进出口动物源性食品中磺胺增效剂残留量的检测方法液相色谱-质谱质谱法.docVIP

《出口蜂蜜中大米糖浆的检测方法 实时荧光PCR法》 编制说明 标准制定的任务来源及意义 任务来源本标准是根据国家认证认可监督管理委员会下达的任务名称为《》，计划编号为2011B15，由中华人民共和国出入境检验检疫局制定2、制定标准的意义 目前在蜂蜜中掺入大米糖浆是一种普遍存在的现象，但是现有检测标准方法在鉴定蜂蜜中的大米糖浆都存在一定的困难。为满足出口检验工作需要，急需建立一种灵敏、简便、准确适用于出口中的方法。 二、编制依据 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化化工作导则 第一部分：标准的结构与编写规则》的要求进行编写。 三、标准制定过程 本标准起草单位在20年月收到认监委的任务下达文件后，。 本标准起草人通过查询相关资料和文献，。四、主要试验技术目前 （一）蜂蜜中蛋白的提取 研究蜂蜜中蛋白及小分子片段的提取方法，在此过程中建立了三种方法，分别为：乙醇沉淀法用字母“E”表示；硫酸沉淀法用字母“S”表示；直接离心法用字母“C”表示。能过比较发现，“E”较稳定，且提取效果好，并将该方法定为本标准的检测方法。 图1为不同蜂蜜不同方法的提取结果 备注：“1”为大米；“1～8”为不同品种的蜂蜜，由室验室提供；“E、S、C”为不同方法 （二）蛋白的裂解 选择适当的裂解液，提高裂解时间从而得到大量的DNA。该过程方法比较成熟，且目前国内外方法及试剂盒方法也大同小异，都可要据情况选择使用。 （三）DNA的提取 由于蜂蜜中大米糖浆及小分子片段含量较低，估再此过程中应尽量减少DNA的提取步骤、并采用多次合并DNA等方法来提高目前的DNA 的含量。 （四）引物的设计 针对大米的内源基因片段，设计特异性高且灵敏度高的引物。并进行大量的外源性的植物DNA的扩增，以此判断该引物的特异性好坏。“1～8”分别为，大米、米粉、水稻、营养米、米果、米线、烧卖、糯米；“9”为玉米。“10～17”分别为米饭、米、米粉、小米、麻团、黑米、糙米。通过该实验可以发现，引物特异性较好，没有出现交差干扰，不会出现假阴性。 图2米及米制品扩增曲线图 下图“1～29”分别为小麦、大豆、油菜、大麦、甘蔗、黑豆、茶叶、菊花、甜菜、洋槐、桃花、土豆、玉米、海棠、复合花粉1、复合花粉2、高粱、荔枝叶、西红柿种子、黄瓜、韭菜、薰衣草、梨花、紫萝兰、牡丹、月季、杏花、竹子叶、玫瑰。通过该实验可以看出，引物特异性好，没有外源基因扩增干扰。不是会出现假阳性。 图3非米植物的DNA扩增 （五）PCR条件的优化 通过调整反应条件，使PCR反应更灵敏。 图4 PCR反应调整前，GOS基因的扩增 图5 PCR反应调整后，GOS基因的扩增 （六）验证工作 将所得的大米糖浆与已知PCR阴性三种蜂蜜进行不同比例的混合，并分批进行PCR实验，从而确立方法的检测水平。 图6 三种蜂蜜分别与糖浆进行0.5：1混合后的PCR扩增曲线 图7三种蜂蜜分别与糖浆进行1：1混合后的PCR扩增曲线 图8 三种蜂蜜分别与糖浆进行2：1混合后的PCR扩增曲线 图9 三种蜂蜜分别与糖浆进行3：1混合后的PCR扩增曲线 图10三种蜂蜜分别与糖浆进行4：1混合后的PCR扩增曲线 根据结果不难发现随着糖浆添加比例的越来越少，GOS基因的扩增曲线也越来越低，当糖浆含量接近25%时就很难提取出。本次检测线灵敏实验只针对用实验室所提供的糖浆作为标准物质所配成的标准浓度。由于糖浆工艺的千变万化，也可能导致检测线的不稳定性。实验进一步发现，该方法的检测灵敏度与所选蜂蜜的种类影响不大，故在进行方法灵敏度实验时，可考虑1～2种蜂蜜做为基质即可。 五、参考文献 GB/T 1.1-2009《标准化化工作导则 第一部分：标准的结构与编写规则》 PCR条件优化 引物设计 DNA的提取 蜂蜜中蛋白的提取 蛋白的裂解 验证工作