根癌农杆菌介导Pti4基因转化豇豆研究.pdfVIP

摘 要 本研究以‘成豇七号’、‘广东金冠’、‘白沙十七’、‘摘不完白籽泰豆’、‘宏达 雪豇豆’5个豇豆栽培品种为材料， 探讨不同基因型、不同浓度生长调节剂对豇 豆子叶节诱导不定芽和再生的影响，以豇豆子叶节为外植体，建立了豇豆再生体 系。以‘成豇七号’为材料，通过农杆菌介导的子叶节侵染和子房原位转化两种 方法，将番茄抗病转录因子Pti4基因导入豇豆，并对转化材料进行PCR检测， 筛选出转化环节中各影响因子的最佳参数，为豇豆转化提供参考和技术支撑。主 要研究结果如下： 1． 研究了不同浓度6-BA对豇豆子叶节再生整个过程的影响，在豇豆种子萌发 阶段，6-BA的添加有利于形成壮苗及促进后期不定芽的诱导，3．0mg／L为 最佳浓度；诱导阶段的6-BA最佳浓度为1．0 mg／L，伸长阶段为O．5 mg／L， 诱导的不定芽数为5．37个。 2． 为解决不定芽的伸长问题，在诱导和伸长阶段添加KT，伸长效果显著，最 佳浓度为0．06mg／L，和对照相比，在不定芽诱导数和芽长上都有所增加， 平均芽数为5．97个，培养4周后的平均芽长为2．62cm。 3． 实验同时比较了TDZ前处理的影响，无菌苗阶段添加O．01mg／L TDZ能够 达到最佳诱导效果，诱导的不定芽数为5．56个。 4． 豇豆不定芽在不添加任何激素的培养基上和添加O．5mg／L IBA的培养基上 都能较好的生根，生根率都能达100％，IBA的添加使生根的启动时间由7．5d 缩短为6．3d。 5． 5种基因型的豇豆子叶节不定芽诱导率存在差异，‘成豇七号’、‘广东金冠’ 优于其它三个品种，芽诱导率分别为95．45％和1 92．75％，诱导的芽数分别为 5．40和5．91个。 6． 在农杆菌侵染子叶节的方法中，分别探讨了Kan、Cef对豇豆子叶节再生的 影响，TDZ和6-BA前处理、预培养时间、侵染时间、共培养时间及pH等 对遗传转化体系建立的影响。确定豇豆子叶节对Karl的抗性浓度为 1 10mg／L，子叶节从无菌苗上切下一周后转入筛选培养基，筛选3周为最佳 筛选方式。Cef抑制农杆菌的最佳浓度为200 mg／L。在遗传转化体系建立过 万方数据 程中，TDZ前处理优于6-BA前处理，预培养时间为24h、侵染时间20min、 共培养时间2d、侵染液pH为5．8时分别有利于抗性芽的诱导。 7． 田间用子房原位转化法，选当天开的花，采用花柱全切的方式，以农杆菌 菌液侵染子房切口，分别在当天三个时间段侵染，结果发现12点之前处理 的花几乎全部脱落，下午3点到6点之间处理的花收获到种子。 关键词：豇豆；子叶节再生体系建立；抗病转录因子Pti4；农杆菌介导；子房 原位法 万方数据 Abstract In this research．a stable and high．efficiency plant regeneration system was established via cotyledonary node explants of‘Chengiiang 7’‘Guagndong jinguan’ ‘Baisha 1 7’‘Zhaibuwan’and‘Hongda’．The tomato disease．resistant transcription factor Gene Pti4 was translated into‘Chengjiang 7’through Agrobacterium—mediated cotyledonary node infection and ovarian in planta transforlrlation．Moreover,the transformed material was detected bv PCR．the transformation steps were screened and optimum parameters of each factor was selected．The results Can provide some reference and technical support for cowpea transgenosis．The main results were as following： 1．W．e investigated the effect of different concentration of 6．BAon the whole process of regeneration of cowpea cotyledonary node．At the stage of germination，adding 6．BA will facilitate the formation of strong seedlings a