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第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶 能识别特定的核酸序列而将核酸切断 * * 重组DNA （recombinant DNA）是人工进行基因的剪切、拼接、组合。基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）。因此，酶是DNA重组技术中必不可少的工具，基因工程中所要用的酶统称为工具酶。 切除核酸5’末端磷酸基 碱性磷酸酶 降解除RNA RNA酶A 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 DNA酶Ⅰ 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端 S1核酸酶，绿豆核酸酶 在3’末端加入同质多聚物尾 末端转移酶 连接两个DNA分子或片段 DNA连接酶 聚合酶链反应（PCR） 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） ①缺口平移制作标记DNA探针 ；②合成cDNA的第二链；③填补双链DNA3’凹端；④DNA序列分析 DNA聚合酶Ⅰ 或其大片段（Klenow） 识别DNA特定序列，切断DNA链 限制性核酸内切酶 主要用途 酶 常见的一些工具酶 按酶的来源细菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。 如：流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ； 埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli ） 抗药性菌株中分离到限制性内切酶EcoRⅠ。 用处不大 应用广泛 无应用价值 在重组DNA中应用 特异切割 特异切割 随机切割 切割方式 在识别序列下游24-26bp处 在特异序列内部或附近 距识别序列至少1000bp 切割位点 特异性、非对称序列 特异性、旋转对称序列 特异性、非对称序列 识别序列 ATP、Mg2+、SAM Mg2+ ATP、Mg2+、SAM 限制作用的辅助因子 酶蛋白同时具有甲基化作用 酶蛋白、不具有甲基化作用 酶蛋白同时具有甲基化作用 限制与修饰作用的关系 二亚基双功能 单一功能的酶 三亚基多功能酶 结构、功能 Ⅲ型 Ⅱ型 Ⅰ型 限制性核酸内切酶类型 识别序列 多数限制酶识别4-8bp的回文序列（序列相同，方向相反），如EcoRⅠ限制酶识别6bp回文序列，其切割产物是两条双链片段（称为限制片段），其5’ 端是带有磷酸基的单链突出端，而3’ 端具有游离的羟基。 酶切条件：温度、离子浓度、pH、酶切时间等 SmaⅠ 30℃ SfiⅡ 50℃ 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-G-OH 3-CTTAA-P P-AATTC-3 OH-G-5 EcoRⅠ 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 EcoRⅤ 5-GAT-OH 3-CTA-P P-ATC-3 OH-TAG-5 粘端 （Cohensive end） 平端 （blunt end） 粘端与平端 二、 DNA聚合酶Ⅰ ① 5’→3’的聚合作用——修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 ② 3’→5’的外切酶活性——消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。 ③ 5’→3’外切酶活性——切除受损伤的DNA，应用在切口平移（nick translation）中。 1、大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase） ① 5’→3聚合酶活性——补齐5’突出粘性末端的单链，在DNA连接酶作用下与另一平端DNA连接；供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。 ② 3’→5’外切酶活性 2、Klenow片段——完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段 3、T4噬菌体DNA聚合酶 ① 5’→3 ’聚合酶活性——补齐5’突出粘性末端的单链，在DNA连接酶作用下与另一平端DNA连接；供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。 ② 较强的3’→5’外切酶活性——双链DNA平端标记。 4、Taq DNA聚合酶 最初来源极度嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus，具有5’→3 ’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，需Mg2+作辅助因子——应用于聚合酶链式反应（PCR）中对特定DNA序列的扩增。 三、DNA连接酶 最常用的是T4DNA连接酶（T4DNA ligase），催化双链DNA中相邻的3’-OH与5’-磷酸基团之间形成磷酸二酯键，它可用来连接具有粘性