4. 基因工程.ppt

真核表达载体的研制方向： 多基因表达 多基因融合表达 多启动子 内部核糖体进入位点（IRES） 制造剪接位点 定位表达: N，ER，Gogi, plasma, membrance Protein sorting, signal protein 可调控性表达: Tet-on/off 特异性表达 Cell-specific promoter: AFP… 表达载体的选择 表达蛋白的目的 需要哪种附加物 应选择哪种筛选标记 在哪种细胞中表达 外源基因的长短是否合适 常用的哺乳动物细胞的种类 常用于稳定表达的细胞 CHO细胞等 常用于瞬时表达的细胞 COS细胞 含SV40T-抗原－SV40 HEK293 含腺病毒E1A基因－CMV 转染：指真核细胞主动摄入或被动导入裸DNA并获得新遗传表型的过程。 方法：磷酸钙转染Hepes+Cacl2+DNA DEAE葡聚糖介导转染正电荷DNA负电荷 电穿孔低电压（150v）,高电容 脂质体转染疏水DNA亲水 显微注射细胞核 Transfection: Acquisition of new genetic markers by incorporation of added DNA to the eukaryotic cells. 转染细胞的筛选 ? 药物筛选 Neor G418 （氨基糖苷磷酸转移酶 干扰核糖体） Hygror Hygromycin（潮霉素B磷酸转移酶 蛋白合成转位及错误翻译） purr Purimycin （氨基糖苷磷酸转移酶） ZeocinrZeocin 细菌、细胞通用 ADA选择培养基，dCF抑制内源性ADA，Xyl-A磷酸化Xyl-ATP结合核酸 报告基因（启动子 增强子） 表位标签（GFP） 真核细胞表达外源基因必须注意： 1. 真核细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件。 2. 不同类型的细胞具有不同的特性,注意选择体细胞。 酵母：酿酒酵母、毕赤酵母 杆状病毒宿主：sf9、sf21 哺乳动物细胞：COS、CHO….. 表达方式 瞬时表达：无需筛选 稳定表达：整合染色体/抗药性，需筛选 表达产物的检测 基因转录产物： RT-PCR， Northern-blot 基因翻译产物： SDS/Western-blot, ELISA, RIA 真核细胞表达的发展趋势 体内表达 组织特异性表达 定位表达 定量表达 * 右下角图标有超级链接回到一 自然界的基因转移和重组 * 左下角图标有超级连接到二 重组DNA技术 * 切口、配伍末端处均有相应超级链接 * * * 基因组DNA文库、 cDNA文库旁图标处均有相应超级链接 左下角图标有超级链接到二 重组DNA技术 * 左下角图标有超级链接到目的基因的获取 * 右下角图标有超级链接到目的基因的获取 组成： -10区（TATA box, pribnow box）：核心酶-35区：?亚基 类型： 1.Lac乳糖操纵子的启动子: IPTG 2．PL/P R噬菌体启动子: 42OC 3．trp启动子: ?-吲哚丙烯酸 4．tac启动子: IPTG 5. T7, T3, SP6: IPTG 启动子 核糖体结合位点(SD序列) mRNA上富含嘌呤的核苷酸序列，与大肠杆菌 16s rRNA 3’末端富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA 的识别与结合位点，其保守序列为5‘AGGAGGU3’ SD sequence: AG-rich sequence (consensus=AGGAGGU) that is complementary to a sequence at the 3’-end of E.coli 16srRNA. Base pairing between these two sequences helps the ribosome bind an mRNA 终止子 终止转录的特定DNA序列 Terminator: A specific DNA sequence that signals transcription to teminate. 结构特点： G/C丰富区和A/T丰富区 茎环结构+串U TTGACA TATATTA AGGAGGT ATG Transcription S-D sequence DNA Couterpart -10 region -35 region Terminator MCS Target gene Schematic diagram of p