超声和高压处理对牛血清白蛋白结构的影响(精选).docVIP

超声和高压处理对牛血清白蛋白结构的影响 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(1):46～49 罗昭锋*瞿鑫沐万孟时青张毅 (中国科学技术大学生命科学学院生命科学实验中心合肥230027) 摘要目的：研究牛血清白蛋白经过超声和高压处理前后的结构变化，以及自由基清除剂对其结构变化的影响。为进一步研究细胞破碎和乳化蛋白时超声和高压处理对蛋白的影响提供参考。方法：将BSA溶液经过超声和高压处理，然后利用高效液相色谱（HPLC）、动态光散射（DLS）、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（nondenaturing SDSPAGE）以及园二色谱（CD）等手段检测处理前后的结构变化。结果：发现超声使BSA严重聚集，加入自由基清除剂可以减少聚集的产生。而高压处理后的BSA未出现聚集，但二级结构发生了变化。结论：超声和高压这两种处理方法对蛋白损伤机理不同，所以选择合适的破碎方法要根据蛋白自身的性质而定。 关键词牛血清白蛋白超声处理高压处理细胞破碎 中图分类号Q518.1 收稿日期：20050711修回日期：20051020 *电子信箱：lzf@ustc.edu.cn破碎细胞是制备胞内蛋白的必需途径，目前用于细胞破碎的方法主要有超声破碎法和高压破碎法。但迄今为止这两种破碎方法对目标蛋白的影响并没有一个明确的结论。 超声破碎的机理涉及多种因素，包括空穴产生与复合伴随的高温（几千K）高压（几百个大气压）变化、机械剪切力、气液界面的作用以及自由基的产生带来的理化效应［1］。超声可以使一些大分子降解［2,3］、结构改变［4］、形成聚集体以及化学键断裂等［5］。高压破碎的机理主要是由于样品流出时，细胞内外压力降低的速度不同，在膜两侧形成巨大压力差，使细胞膜破裂；出口处液体高速流动产生的剪切力也会导致细胞破裂［8］。高压处理还可用于乳化、制备脂质体以及降解高分子等［6,7］。 已有作者对两种方法的差别进行了探讨。在制备β－内酰胺酶［8］和氯霉素乙酰基转移酶（CAT）［9］时高压破碎效果较好。而在制备β半乳糖苷酶［10］和核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶［11］时，超声却要优于高压破碎。 探讨两种方法作用机理上的差别对选择正确的破碎方法具有重要的指导作用。已有的工作都是以细胞作为样品，以目标蛋白的活力作为检测指标，可以直观地反映出破碎方法的优劣。但是难以了解破碎过程中目标蛋白结构的变化以及产生这种变化的机理。本文直接以牛血清白蛋白（BSA）作为研究材料，比较高压和超声处理下BSA结构的变化。为探讨这两种处理方法在破碎细胞以及乳化蛋白时对蛋白的损伤机制提供一定的实验基础。 1材料与方法1.1试剂和仪器 牛血清白蛋白(Sigmaaldrich公司，A7030)。超声破碎仪VC750 (Sonics公司)。高压破碎仪 (FRENCH PRESSURE CELL PRESS) FA078（Thermo Spectronic公司)。HPLC：Waters高效液相色谱仪（600泵，2487紫外检测器）。园二色谱仪 J810 CD谱仪(JASCO公司)。动态光散射仪：Dynapro MS800（PROTEIN SOLUTIONS公司）。 1.2实验方法 1.2.1蛋白溶液的配制称取一定量的BSA溶解于1×PBS (137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 4.3mmol/L Na2HPO4, 1.4mmol/L KH2PO4， pH7.2)，终浓度1mg/ml。 用0.22微米的微孔滤膜过滤，超声脱氧，高速离心(15 000g，10min ，4℃),取上清储于4℃备用（24h以内使用）。 1.2.2样品的超声处理将35ml样品置于50ml烧杯中，超声波处理（450W，破碎1s，间歇1s）。分别在处理0min、1min、2min、3min、4min、5min、6min、8min和10min后取样，所对应的样品编号为U0、U1、…、U8、U10。 1.2.3样品的高压处理样品体积15ml，压力20 000psi,流速15~20滴/min。同一样品连续处理4次，处理前及每次处理后均取出1ml作为待检样品(分别记为P0,P1,P2,P3,P4;其中P0为未处理的BSA，P1~P4分别表示BSA经高压破碎处理1~4次的样品)。 1.2.4HPLC检测条件上样量20μl，分离柱为Waters Protein 300SW，分离范围10~300kDa。检测波长280nm，柱温为室温，流动相PBS（同上）流速075ml/min。数据处理软件为Waters公司的Millinum32。 1.2.5CD谱测试条件样品浓度为160μg/ml，每个样品测量3次取平均。控制程序为Spectra manager；测量时