实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定.pptVIP

实验一 蛋白质的两性反应及等电点的测定 一、实验目的 1、了解蛋白质的两性解离性质。 2、初步学会测定蛋白质等电点的方法。 3、学会正确使用吸量管吸量试液。 二、实验原理 蛋白质分子除含有一定的自由氨基和羧基外，还含有酚基、巯基、胍基、唑基等，因此，蛋白质和氨基酸一样也有两性电离的性质。在溶液中，蛋白质的解离状态受溶液酸碱度影响，酸性溶液中蛋白质解离成阳离子，碱性溶液中则解离成阴离子。等电点时，蛋白质分子所携带的正负电荷相等，以兼性离子存在，在电场中不向正负电极移动，在溶液中溶解度最小，容易沉淀析出。 不同的蛋白质等电点不同，可利用溶解度来测定其等电点。向各种不同pH值的缓冲溶液中加入酪蛋白，以沉淀出现最多的缓冲液的pH值为酪蛋白的等电点。 三、试剂和器材 1、试剂 （1）0.5%酪蛋白溶液 （2）酪蛋白乙酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水20毫升及1.00 mol/L氢氧化钠溶液5毫升(必须准确)，摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00 mol/L醋酸5毫升(必须准确)，倒人50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10 mol/L乙酸钠溶液中，酪蛋白的浓度为0.5%。 （3）0.01％溴甲酚绿指示剂。（4）0.02 mol/L盐酸溶液。 （5）0.10 mol/L醋酸溶液。 （6）0.01 mol/L醋酸溶液。 （7）1.00 mol/L的醋酸溶液 （8）0.02 mol/L氢氧化钠溶液。 （二）酪蛋白等电点的测定 1、取7支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。加入每种试剂后应混合均匀。   2、静置约20分钟，观察每支试管中溶液的混浊度，以一，十，十十，十十十，十十十十符号表示沉淀的多少。根据观察结果指出哪一个pH是酪蛋白的等电点？ 该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。实验中应严格按照定量分析的操作进行。  思 考 题 何谓蛋白质的等电点？ 在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。 * * * 等电点时，蛋白质以兼性离子存在，容易沉淀析出。 剂i] 2、仪器 （1）恒温水浴箱 （2）温度计 （3）100 mL容量瓶 （4）50 mL容量瓶 （5）吸量管 （6）试管 （7）试管架等 四、操作方法 （一）蛋白质的两性反应 1、取1支试管，加0.5％酪蛋白溶液20滴和0.01%溴甲酚绿指示剂5—7滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。 2、用细滴管缓慢加入0.02 mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH按近于酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 3、继续滴入0.02 mol/L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化．并说明原因。 4、再滴入0.02 mol/L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。继续滴入0.02 mol/L氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化? 说明了什么问题？ 剂i] 剂i] 剂i] 沉淀出现情况 5.6 5.3 5.0 4.7 4.4 4.1 3.8 溶液最终pH 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 酪蛋白乙酸钠 1.25 2.5 － － － － － 0.01 mol/L醋酸 － － 0.5 1.0 2.0 4.0 － 0.10 mol/L醋酸 － － － － － － 0.8 1.00 mol/L醋酸 2.75 1.5 3.5 3.0 2.0 － 3.2 蒸馏水 加 入 试 剂 (ml) 7 6 5 4 3 2 1 试 管 编 号 剂i] 剂i] *