研究生课程-细胞培养与应用分析.ppt

Bioengineering College Dalian University 培 养 板 Bioengineering College Dalian University 冻 存 管 Bioengineering College Dalian University 刻度吸管和电动移液器 Bioengineering College Dalian University 实验室动物细胞培养的一般过程 动物细胞小规模培养方法有： 培养瓶培养法、培养板培养法、培养皿培养法。 准备工作： 1.器材的清洗、包装和灭菌 2.培养液及其他培养用液的配置 Bioengineering College Dalian University 细胞培养 原代培养： 组织块培养法——用剪刀将组织剪成小块 组织消化培养——用酶液将组织小块进一步分散 成细胞团或单个细胞 传代培养——细胞覆盖80%-90%是传代的最佳时期 Bioengineering College Dalian University 组织块培养法 Bioengineering College Dalian University 组织消化培养 取材分离 组织消化（胰蛋白酶、胶原酶） 培养过程 Bioengineering College Dalian University 传代培养 Bioengineering College Dalian University 动物细胞贴壁培养的生长阶段 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） Bioengineering College Dalian University 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态；也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 一般游离期持续10分钟——4小时 Bioengineering College Dalian University 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期结束。 贴壁表面要带阳性电荷和高度的表面活性；一般用于细胞培养的表面是玻璃、塑料、金属和微载体。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。 血清中有促使细胞贴壁的带正电荷的糖蛋白（生长基质），这些促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再附着于吸附的促贴壁因子。 Bioengineering College Dalian University 细胞贴壁过程 Bioengineering College Dalian University 潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 Bioengineering College Dalian University Bioengineering College Dalian University 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 培养细胞的活力测定 Bioengineering College Dalian University 台盼蓝法测细胞活力 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 Bioengineering College Dalian University 细胞冻存和复苏 1.冻存和复苏的原则：慢冻快融 2.在细胞冻存时加入低温保护剂能大大 提高冻存效果。 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。获得较好的冻存效果的方法： Bioengineering College Dalian University 1.预先配制冻存液：含20%血清培养基、10% DMSO 2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106-5×106细胞/mL) 3.1mL/管分装于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 4.1年后，存活率可达80％一90％。 细胞冻存方法 DMSO液先用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。 Bioengineering College Dalian Uni