Western blot操作.docVIP

Western blot的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE） A：实际操作 做胶前的准备 1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。 2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。 3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。 制胶，电泳 1）装好架子。 2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，Total： 8ml) 7.5％ 10％ 15% 2×Sep. buffer 4 4 4 30％ Gel.sol 2.0 2.7 4 ddH2O 1.9 1.2 0 TEMED 8ul 8ul 8ul 10%APS 80ul 80ul 80ul 在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。 3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，Total： 3.5ml) 3％ 2×Stacking. buffer 1.7 30％ Gel.sol 0.35 ddH2O 1.4 TEMED 5ul 10%APS 50ul 倒好后插入预先准备好的梳子。 4)待胶凝集好后，上样，电泳。 上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5小时左右。 B ：注意事项及常遇到的问题 1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。 2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。 3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。 4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。 5）电泳中常出现的一些现象： ︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 ︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散：加样量过多。 三、转移 在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。 膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。 A 湿法 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。 2.????? 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。 3.????? 装配转移三明治：海绵?3层滤纸?胶?膜?3层滤纸?海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。 4.????? 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为 0.3A）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。 5.????? 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜 Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小时。 五、孵育一抗 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释， 最好采用梯度稀释。 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上 抗原量适当延长或缩短时间。 注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。 六、洗涤 用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。 洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，