医学微生物实验常用教学菌种保存方法的比较.docVIP

医学微生物实验常用教学菌种保存方法的比较 　　【摘要】目的：探索最适宜的教学菌种的保存方法。方法：采用六种方法将细菌保存一年，复苏后比较各保存方法后菌种的存活率和生化指标等。结果：用脱脂牛奶冷冻干燥保存法、脱脂奶粉冷冻干燥保存法保存菌种1年后存活率高达100%，且菌种的形态和生物学特性未改变。滤纸片低温冷冻保存法、甘油原液低温冷冻保存法保存菌种1年后菌种存活率为94.62%，保存液低温冷冻保存法保存菌种1年后存活率在99% 以上，半固体低温冷冻保存法保存菌种1年后存活率仅为66.54%。结论：脱脂牛奶冷冻干燥保存法、脱脂奶粉冷冻干燥保存法较其他保存菌种方法时间长，可用于各菌种保存，稳定性好，存活率高，适用于有条件的实验长期保存菌种。 　　【关键词】菌种保存；保存方法；比较 　　菌种作为一项重要的生物资源，是医学微生物教学和研究的重要工作，同时与临床疑难菌株的鉴别分离有着密切联系。菌种保存方法因菌种而已，适宜的保存方法不仅可以保证细菌的存活，而且能保证细菌在形态、毒性及生化指标的稳定。本实验在比较各菌种保存方法优缺点的基础上，探索合适的菌种保存方法，选择简单易操作，对设备要求低的菌种保存方法以用于微生物的实验教学。 　　1材料与方法 　　1.1 材料 　　（1）供试菌种： 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、伤寒沙门菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、乙型副溶血性链球菌、变形杆菌等。（2） 培养基： 普通营养琼脂、半固体、血琼脂培养基。（3）1.5ml EP管，2ml冻存管。（4）标签纸，封口胶布。（5）真空冷冻干燥机，-70℃ 冰箱。 　　1.2 保存方法 　　滤纸片保存法[1]：打孔器制取d=3mm圆形滤纸片，10ml普通试管加塞高压消毒灭菌备用，用灭菌镊子夹取滤纸片于平板上正反面蘸取待保存菌种的纯菌落1-2个。放于高压消毒灭菌后的1.5ml EP管再用封口胶带将盖边缘封好于-70℃冰箱保存。 　　甘油原液保存法：将纯化后的待保存菌种，用高压消毒灭菌后的滤纸片正反面蘸取1-2个菌落，置于1.5ml EP管中，滴加0.3ml甘油原液，胶带将盖边缘封好于-70℃冰箱保存。 　　菌种保存液法：配制：K2HPO4?：12.6g，柠檬酸钠0.98g，MgSO4?7H2O：0.18g，KH2PO4： 3.6g，甘油88g加蒸馏水至1000ml，121℃灭菌30分钟，4℃保存备用[2]。将细菌接种于普通琼脂平板或血平板，37℃培养24h后，加入3ml备用的菌种保存液，刮取菌落，洗下菌苔充分混匀。微量加样器取0.5ml菌液分装于2ml冻存管中，将盖拧紧于-70℃冰箱保存。 　　半固体保存法：将普通琼脂高压消毒灭菌后，无菌环境下取1ml分装2ml冻存管中，加盖备用。将待保存的菌种平板划线分离后，用接种针取单个菌落穿刺接种到备用的半固体培养基中，加盖拧紧在37℃ 下培养24h后，存放于-70℃冰箱保存。 　　脱脂牛奶冷冻干燥法[3]：鲜牛奶煮沸，冷却脱脂，8磅15min灭菌备用。取3ml脱脂牛奶加入待保存菌种平板内，用取菌环刮取菌落，轻轻磨匀。以微量加样器量取0.3ml脱脂牛奶菌悬液加入2ml冻存管，加盖拧紧4℃冰箱保存20min，再转到-20℃冰箱速冻30min.取出后，将盖稍拧松放于真空冷冻干燥机中，真空干燥24h。冷冻干燥结束后，将盖拧紧，于-70℃冰箱保存。 　　脱脂奶粉冷冻干燥法：配备15%奶粉乳液，煮沸冷却脱脂，8磅15min灭菌备用。取3ml脱脂奶粉乳液加入待保存菌种平板内，用取菌环刮取菌落，轻轻磨匀。以微量加样器量取0.3ml菌悬液加入2ml冻存管，加盖拧紧4℃冰箱保存20min， 再转到-20℃冰箱速冻30min。取出后，将盖稍拧松放于真空冷冻干燥机中，真空干燥24h。冷冻干燥结束后，将盖拧紧，于-70℃冰箱保存。 　　1.3 活力检测方法 分别于保藏后3、6、9、12个月进行复苏。从-70℃取出一套保存的菌种，37℃水浴快速解冻，根据菌种不同特性，选择不同培养基复苏，检测细菌的存活情况，计算存活率[4]。并结合教学实验进行细菌的形态、染色特性观察、生化反应指标检测和毒力的检测等，比较各教学菌种生物特性是否发生变化。 　　存活率=（菌株存活数/受检菌株数）×100% 　　2结果 　　6种方法保存1年后存活数量及存活率见表1。统计学分析，各组在存活率存在差异。脱脂牛奶冷冻干燥法和脱脂牛奶冷冻干燥法保存效果最好，复苏后全部存活，在细菌的形态、染色特性观察、生化反应指标检测和毒力的检测方面未发生改变。保存液法也能起到较好的保存作用，在短期保存效果上与以上两种方法相同。滤纸片法和甘油原液法在存活率及各项检测指标并无差异。半固体法一年内存活效果最差，复苏后细菌形态发生改变，部分生化指标异常。 　　3讨论