讲义好东西.docVIP

第三章 基因克隆载体 第一节 载体的功能及其特征 载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 一、载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 　五、质粒的制备 　　实验室一般使用两种方法制备质粒：　（一）碱裂解法　　（1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中　　（2）加溶菌酶裂解细菌细胞壁　　（3）加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物　　（4）加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质　　（5）离心取上清液，用苯酚－氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶　　（6）乙醇或异丙醇沉淀水相质粒　　（7）无DNase的RNase处理残余RNA　　用此方法制备的质粒较纯，收得率高，但繁琐，且质粒中有开环现象　（二） 沸水浴法　　（1）将菌体悬浮浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液中　　（2）加溶菌酶破细胞壁　　（3）放入沸水浴中煮40秒　　（4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物　　（5）乙醇异丙醇沉淀　　用此法制备的质粒不纯，收得率低，且制备规模小，但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。 ????????????????????????????????????? 图3-6?? pGEM3Z载体的结构及外源DNA的转录??????????????????????????? ?????????????????????????????????????????? ??? 图 3-7细菌DNA的提取???????????????????????? 图3-8 质粒DNA提取方法 图3-9 CsCl梯度离心法纯化质粒DNA 第三节 以噬菌体DNA为基础的载体 一、λDNA载体（一） λ噬菌体的分子生物学　　 λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成　　1) λ-DNA的物理图谱　　　λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。例如，所有的编码外壳蛋白的基因都聚集在左端1/3处；控制基因组整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控的基因；相关基因的聚集对λ基因组的表达是非常重要的，这能够使他们一起启动或关闭，而不是单独起作用。 ????????????????????????? 图3-11 cos位点的作用 　　2）感染周期 　　　噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入　　（1）吸附 吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故它也可促进λ噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）。　　（2）DNA注入 　　（3）DNA复制 从单一ori区滚筒复制，形成线状多联体，λ-DNA上两个基因的产物激活复制的起始，但复制所需的蛋白因子系统则由宿主细胞提供。　　（4）包装 包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此cos区对包装是至关重要的。　　　包装时由一个蛋白因子将cos区切开，从而保证只有一个DNA 线状负责被保证在一起，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的λ-DNA分子，包装对DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装λ-DNA分子的75%-105%，也就是说可以包装36.4kb-50.9kb范围内的DNA，包装好了的λ-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。　　（5）裂解 每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。 ??????????????????????? 图3-12? λ噬菌体的侵染循环　　3）溶源状态的建立　　　噬菌体感染大肠杆菌后除了可能裂解细胞外，也可能直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不裂解细菌，这种情况的为溶源状态，整合重要由-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使λ-DNA或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。 （二） λ－DNA载体的构建　　建立λ克隆载体前需要解决2个问题　　1） λDNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。　　2） λ基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成λ基因组。　　Ⅰ. 缩短长度　　　野生型