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2）大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。 培养条件：25℃、7天，控制湿度 大米孢子的要求：1粒米含1.4×106个孢子 * 3）一级种子（小罐又称发芽罐） 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 目的：孢子发芽 培养条件：27℃，40小时 4）二级种子（中罐又称繁殖罐） 培养基：同上 培养条件：27℃、10-24小时 目的：长菌体 * * 发酵级数确定的依据 受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响， 一般2-4级。 * 级数大，难控制，易染菌，易变异； 级数小，延长发酵周期。 4、接种量的确定 移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积 接种量的大小取决于菌种在发酵罐中的生长繁殖速度。 通常接种量，细菌1-5%，放线菌7-15%，酵母5-10%， 霉菌7-15%，有时20-25%。 * 采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体形态 接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响 * 图1 　不同接种量对菌体生物量的影响　　　　图2 不同接种量对γ-亚麻酸产量的影响 ■1 ×107 孢子/ ml 　□0.5 ×107 孢子/ ml 　●1 ×106 孢子/ ml 　 ○1 ×105 孢子/ ml 　▲1 ×104 孢子/ ml * 双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 如：卡那霉素，双种比单种提高8％ 倒种：以适宜的发酵液倒出适量给另一发酵罐作种子 如：链霉素发酵中，倒种比单种提高12％ 混种：以种子液和发酵液混合作为种子 * 5、种龄 指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子 罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度 相对较大，但是最终由实验结果定。 * 接种龄在12h * 五、影响种子的质量因素 1、培养基 2、培养条件，如温度、湿度、通气量、pH等 3、种龄、接种量与种子罐级数 * 六、无菌接种 生产规模的发酵罐接种有两种方式 ——从摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐 ——从一个种子罐移入另一个发酵罐中 * 从摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐 /programs/view/kN6IYjRvSiU/ * 从一个种子罐移入另一个发酵罐中 * 本 章 小 结 掌握工业微生物具备的特征 了解常用的基因表达系统、菌种选育的方法 掌握目的微生物分离的方法、自然选育、诱变育种 了解种子扩大培养的原因 掌握菌种的驯化与活化 掌握生产车间种子制备概要 * * * 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 * 基因突变： 自然选育、 基因重组： 杂交、 基因的直接进化： 点突变、 诱变育种 原生质体融合、 基因工程 错位PCR、 DNA Shuffling 五、菌株选育、分子改造 * 突变原因： 自然突变有两种情况： 负突变： 正突变： 自然选育 表现为菌株的衰退和生产质量的下降。 对生产有利。 多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。 机率为10-8～10-9 无人工参与的情况下，微生物的自然突变进行菌种选育的过程。 * 自然选育在工业生产上的意义 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产 的重要措施。 回复突变： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降。 * 自然选育操作步骤： 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验 * 诱变育种 用各种物理、化学的、生物的因素人工诱发基因突变进行 的筛选，称为诱变育种。 理论基础：突变，包括染色体畸变和基因突变两类。 * （一）、常用的诱变剂 诱变剂 物理： 化学： { 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。 生物： 紫外线（253－265nm）、快中子、航天育种 氮芥、亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES) 噬箘体、转座子 * 化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择 （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 自然界分离得到的野生型菌株；经诱变处理过的高产菌株。 （杀菌率在70-80％） * （三）、诱