分子信标技术分析.pptVIP

分子信标技术 分子信标简介 分子信标的结构 分子信标的工作原理 分子信标的应用 前景与展望 分子信标简介 Tyagi和Krammer于1996年首次建立，目的是在液相中定量测定靶标序列。 基于荧光共振能量转移（FRET）设计的一种新型荧光标记核酸探针； 特殊的发夹结构使得其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强的特点； 广泛应用于分子生物学、生物技术、生化分析，生物医学研究和临床诊断 。 分子信标的结构 经典分子信标结构包括： 1、环状区（长度15～30个碱基的序列，能与目标分子特异结合）； 2、信标茎杆区（长度为5～8个碱基的互补序列，使得形成发夹结构）； 3、5’端荧光基团（徳克萨斯红、荧光素等染料）； 4、3’端猝灭基团（DABCYL ）。 首例分子信标结构示意图 环状区 茎杆区 荧光基团 猝灭基团 分子信标工作原理 无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生FRET，荧光猝灭，荧光背景极低。 加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRET的发生，荧光恢复。 影响分子信标的因素 荧光—猝灭基团间的距离的影响： 环境pH值的影响：pH过高时，茎干区碱基对之间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光基团与猝灭基团分开产生荧光。 E：FRET效率 R：荧光给体与受体之间的距离 影响分子信标的因素 温度对分子信标的影响 1、序列长度（环状序列比茎杆序列长两倍以上，茎杆序列不能过长或过短） 2、茎杆序列中G和C的含量不能太高 3、5’-端的第一个碱基最好不要选择G 4、由于被测对象DNA或RNA是大分子，存在扭曲现象，因此要选择被测对象的外围碱基序列，即容易接近的那段序列来设计信标。 分子信标设计原理 荧光猝灭依赖的是能量共振转移，而转移的效率与荧光基团发射光谱同猝灭基团激发光谱的完全重叠有关。为了荧光能有效猝灭，荧光基团的发射光谱应完全覆盖猝灭基团激发光谱。符合此要求且较常用的荧光剂-淬灭剂有：1、EDANS（5′- (2′-氨乙基氨基奈-1-磺酸)和DABCYL（4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)； 2、苯甲酸6-荧光素和DABCYL?； 3、荧光素和罗丹明、荧光素和芘丁酸?、香豆素和乙锭?荧光素和伊红?、一些铽螯合物和四甲罗丹明等。 分子信标技术常用的荧光剂-淬灭剂 波长转移分子信标 优点： 如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射波长的荧光发射基团，就可在同一激发光下，通过检测这些特征波长的荧光强度，?实现在同一体系中的多基因分析。 波长转移分子信标 表面固定分子信标 量子点分子信标 分子信标的应用 核酸的检测分析 实时定量PCR测定靶标浓度 活体内核酸的动态检测 同时检测多个靶核苷酸 检测双链DNA 分子信标的应用 研究DNA—蛋白质的相互作用 用于核酸酶的研究 用于研究DNA——蛋白质的相互作用 用作生物芯片和生物传感器 应用1、实时定量PCR测定靶标浓度 将分子信标简单地密封在PCR 管中，在每个循环的退火阶段分子信标与扩增产物结合产生荧光，未结合的分子信标不发荧光，这样荧光信号随着反应循环的增加而增强，从而反映出PCR 过程中扩增产物浓度的增加。 由于加有分子信标的PCR 管在整个反应中是密封的，因此可避免传统PCR后扩增产物凝胶电泳过程带来的污染，简化检测手段，检测灵敏度高。 应用2、活体内核酸的动态检测 Perlette 利用微注射法在袋鼠肾细胞质中引入分子信标，对单个活细胞中的RNA 进行了检测，并利用ICCD 成像系统得到了一系列反应分子信标与RNA 结合的荧光图像。结果表明，利用分子信标可以有效地实时检测活细胞中的RNA 及研究RNA/ DNA 的杂交过程。 分子信标的应用-双链DNA检测 PNA与双链DNA互补链结合时可以取代非互补链,使之解链以单链的形式存在,形成P-环结构。特定序列的DNA或PNA分子信标可以与双链DNA的 变性部分结合,分别形成PD- 或PP-环型化合物,分子信标 结构被破坏,出现荧光响应。 最近的实验结果表明,利用 茎-环结构的DNA分子信标 或无茎的PNA分子信标可 以实时检测PNA与双链DNA 的结合位点 Human osteosarcoma cell nucleus (U2OS cell line) vitally injected with a Cy3-labelled probe specific for chromosomal telomeric repeat sequenes. Note that some spots are relatively large suggesting asso