转基因动物技术原理与应用资料.ppt

利用小鼠动物模型研究基因表达与病理发育 郑耀武 转基因动物实验中心 综合实验楼205 zhengyw442@nenu.edu.cn 座机电话号码 转基因动物技术原理与应用 第一部分： 常规转基因技术原理 第二部分： 基因定位修饰技术原理 第三部分： CRISPR/Cas9技术原理与应用 什么是转基因？ 狭义：人为将DNA片段插入基因组 广义：人为的对生物基因组的修饰，包括随机的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定点突变等 动物转基因的重要性 基础理论研究 （小鼠） 研究基因调节，包括启动子功能 基因功能追踪（Knockout，Gene Trap） 细胞追踪，如癌细胞转移（如EGFP基因敲入） 基因表达与胚胎发育，器官发育 基因表达与生物学功能、病理发育 基因突变体表达功能研究 基因相互作用 应用研究 （大动物） 生产活性蛋白：酶，疫苗，抗体，生长因子，蛋白药（蛋白活性要求特异的翻译后修饰） 低生产成本：转基因动物可以传代，可以连续生产，如血浆蛋白，乳蛋白，比细胞培养成本低 病理动物模型，利用动物模型研究疾病发生机理、药效测试 器官移植：解决器官不足，重复感染问题，如猪肝脏 品种改良 GMO ：抗病，高产，营养价值提升 疾病治疗：治疗遗传缺陷，组织再生 转基因技术研究历史 第一个转基因小鼠：1974年 第一个小鼠干细胞：1981年 第一个基因捕获小鼠：1989年 第一个基因敲除小鼠：1997年 第一个克隆动物：2008年 第一个CRISPR/CAS9小鼠 常见转基因技术 常规方法 ：受精卵细胞核DNA显微注射，随机插入，预见性低，但多样性 利用精子转染DNA，效率低，重复性差 利用转坐子进行DNA在基因组的插入，方法复杂，受限多 病毒感染：效率高，随机性低，可带DNA大小受限制，安全隐患，常用于大动物 干细胞／胚胎显微注射：常用于小鼠基因定位修饰，预见性高，费时，大动物不成功 核移植／动物克隆：大动物基因定位修饰唯一途径 CRISPR/Cas9技术：最新发展的，快速、简便、高效基因组修饰技术 真核基因结构与调节 真核基因结构（cis element ：启动子 promoter ，外显子 exon ，内含子 intron ，polyA信号, 活化信号（enhancers , 沉默信号（silencers），封闭区 Insulators 转录因子 trans element transcription factors ，活化因子 activators ，抑制因子 inhibitors 真核mRNA结构：Cap，5’非编码区 5’-UT ，编码区 coding region ，3’非编码区 3’-UT ，polyA 组织专一性调节 tissue-specific regulation, spatial 发育阶段调节 developmental regulation, timingly 诱导性调节 inducible 转录后调节: mRNA剪接和修饰， mRNA的稳定性，蛋白质合成效率，蛋白质半衰期 转基因载体构建 启动子选取 cDNA 选取 Poly A 选用 内含子和封闭区 载体构建 启动子的类型和选取 特异启动子：研究基因调节（lacZ），启动子功能，调节其它基因表达。 用于其它基因表达，一定要查询启动子在转基因动物应用文献，了解启动子完整性 高表达启动子选用：用于高表达某个基因，高表达蛋白生产 广谱启动子应用：显示基因细胞标记（EGFP） 可诱导启动子的应用：用于基因调节，有毒蛋白表达，致命基因的调控 复合启动子：可诱导、高表达、组织专一基因调节系统，用于调节基因或高表达蛋白 表达基因（cDNA）的类别 显示基因 reporters : lacZ, GFP, CAT, AP等 调节基因: Cre, ER-Cre, tTA, tTR,PTX等 蛋白质功能研究：蛋白突变体的表达 基因剪接：研究外显子、内含子功能 商业基因：药用蛋白，改良基因等 生理功能基因: 基因治疗，干细胞移植等 非编码基因：非编码RNA功能研究，siRNA基因沉默, CRISPR/Cas9 gRNA基因组修饰 抗性基因：细胞筛选 其它转基因载体构件选取 poly A ：提供稳定的mRNA 常用poly A: SV40 poly A, ?-Globin poly A 内含子选用：第一个内含子，如?-Globin 内含子 封闭区应用：增加表达几率，减少对周围或被周围基因影响 Loxp, FRT, tetO序列 转基因动物（Founders）鉴定 检测转基因在基因组插入： PCR Southern 拷贝数：Southern, Real time PCR 插入位点：Inverse PCR mRNA表达： In Situ RT-