高效液相色谱柱故障排除课稿.ppt

柱外效应主要影响N值 进样量大主要引起柱子超载，保留时间和N值下降，一般凭经验找到是保留时间和N最大的进样量。一般：0.46mm的色谱柱最大进样量为10-50ug。一般开始时大样品量进样（10-50ug），然后逐渐降低进样量直至保留时间稳定。 色谱峰峰形 二次效应 ASB C18,4.6×150mm，5μm 85% 25mM NaH2Na，15%ACN 1mL/min, 35℃ 10mM的TEA 不加TEA 16 / 400-606-8099 / service@ 色谱峰峰形 金属污染C18硅胶造成的碱性药物的拖尾 a b 初始的硅胶基质 酸洗后的硅胶基质 流动相：20mM三甲胺 硅胶纯度 17 / 400-606-8099 / service@ 色谱峰峰形 柱外效应造成的色谱峰拖尾 色谱柱：150×0.45mm, 硅胶柱 流动相：Hexane-CAN 99:1,V/V 流 速：2.0mL/min 10μL进样阀与8μL检测器流 通池的商品色谱仪 b 0.5μL进样阀与1μL检测器流通池的商品色谱仪 柱外效应 18 / 400-606-8099 / service@ 解决方法： 1、使用流动相溶解样品 2、加大浓度，降低进样量 色谱峰峰形 样品体积：30μL 流 动 相：18% 乙腈-H2O 样品溶剂进样的影响 溶剂效应 19 分别以纯乙腈和流动相为溶剂注 入咖啡因（A峰）与水扬酸胺（B峰）样品 / 400-606-8099 / service@ 色谱峰峰形 色谱柱：Venusil HILIC 5μm 4.6×250mm 流动相：乙腈－水 80: 20 柱温：30℃ 检测器：蒸发光散射检测器 样品：葡萄糖对照品水溶液 流速：1mL/min 葡萄糖端基异构体的转化 — 两个峰 提高温度，或提高pH值，转化加快 — 一个峰 25℃ 80℃ 样品特性 20 / 400-606-8099 / service@ 柱外效应对峰形/分离度的影响 死体积 是指从进样器到检测器 的体积，这一段没有被色谱填 料所填充的部分，死体积大， 会导致峰展宽，峰形变差等等。 色谱峰峰形 21 / 400-606-8099 / service@ 色谱峰峰形 柱外效应对峰形/分离度的影响 尽量减小连接管路体积。 尤其使用窄径柱时！！ 22 / 400-606-8099 / service@ 色谱峰峰形 色谱柱污染 复杂样品基体或待测样品量大 颗粒物堵塞筛板 复杂样品基体或待测样品量大 色谱柱死体积 流动相pH 7时，硅胶溶解 除非使用特殊色谱柱 ，死体积增加。 样品溶剂效应 样品溶剂强于流动相-裂分峰和扩展峰取决于样品量 色谱峰拖尾/扩展/分裂 23 / 400-606-8099 / service@ 1. 色谱柱柱压 2. 色谱峰峰形 3 . 色谱峰保留值 4 . 色谱柱柱寿命 HPLC色谱柱故障 24 / 400-606-8099 / service@ 色谱峰保留值 保留时间变化 漂移（单方向增加或减小 ） 波动（无规律的变化） 25 / 400-606-8099 / service@ 色谱峰保留值 保留时间变化原因 色谱柱平衡 固定相变化 色谱柱污染 流动相组成发生变化 疏水坍塌 26 / 400-606-8099 / service@ 保留时间变化原因 色谱柱平衡 流动相变化 （梯度洗脱的平衡） 温度变化 流速变化 更换色谱柱 至少使用10-20倍柱体积流动相平衡色谱柱 27 / 400-606-8099 / service@ /400-606-8099 * 原则：使用比MP更强的溶剂冲洗 二氯甲烷 丙醇 四氢呋喃 乙醇 乙腈 甲醇 水 * 原则：使用比MP更强的溶剂冲洗 二氯甲烷 丙醇 四氢呋喃 乙醇 乙腈 甲醇 水 * 1，许多色谱峰峰形问题都是复合型问题， 色谱峰扩展和柱效降低 2，色谱峰扩展和拖尾或拖尾随保留加剧 3, * 1，许多色谱峰峰形问题都是复合型问题， 色谱峰扩展和柱效降低 2，色谱峰扩展和拖尾或拖尾随保留加剧 3, * 对于难溶解的物质：小体积强溶剂溶解以后用MP稀释 扫尾剂：30mM的TEA（B性化合物），醋酸胺（A性化合物）， * 柱外效应主要影响N值 进样量大主要引起柱子超载，保留时间和N值下降，一般凭经验找到是保留时间和N最大的进样量。一般：0.46mm的色谱柱最大进样量为10-50ug。一般开始时大样品量进样（10-50ug），然后逐渐降低进样量直至保留时间稳定。 * 流流动相pH 7时，硅胶溶解 除非使用特殊色谱柱 ，死体积增加，动相pH 7时，硅胶溶解 除非使用特殊色谱柱 ，死体积增加， * 某些流动相需要更长的平衡时间：如MP中含有THF；