DC―CIK细胞与顺铂对乳腺癌细胞杀伤作用的研究.docVIP

DC―CIK细胞与顺铂对乳腺癌细胞杀伤作用的研究 　　[摘要] 目的 研究DC-CIK细胞和不同浓度顺铂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用。 方法 将DC细胞和CIK细胞共同培养得到的DC-CIK细胞与顺铂分别作用于MCF-7细胞，共同培养12h、24 h和48 h，MTT法检测MCF-7细胞的增殖抑制情况，对比DC-CIK细胞和顺铂对MCF-7细胞的增殖抑制效果。 结果 与DC-CIK细胞共培养12 h、24 h与48 h，MCF-7细胞均出现一定的凋亡，增殖受到明显的抑制；与5×106个DC-CIK细胞共培养12h与40 ng/mL顺铂对其作用12 h的抑制效果相同，共培养24 h与50 ng/mL顺铂对其作用24 h的效果相同，共培养48 h与60 ng/mL顺铂对其作用24 h的效果相同。结论该研究为DC-CIK法治疗乳腺癌作出了实验室基础性研究，为临床DC-CIK细胞抑制乳腺癌细胞提供了理论依据。 　　[关键词] 树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞；DC-CIK细胞；乳腺癌；免疫治疗 　　[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）03（b）-0124-03 　　树突状细胞（Dendritic cells，DC）是机体内重要的抗原提呈细胞，可激发 B 和 T 淋巴细胞介导的免疫反应[1]。细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine- induced killer cell，CIK）是将人外周血单个核细胞在体外与多种细胞因子及抗体共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，对肿瘤细胞具有高效的溶解毒性[2]。DC能识别处理肿瘤细胞，并把肿瘤细胞的相关信号传递给CIK细胞，使之发挥杀伤肿瘤细胞的功能。因此，DC能显著提高CIK细胞针对肿瘤细胞的杀伤活性[3]。[A1]本次实验的起止时间为2012年10月―2013年7月，实验从正常人外周血中分离DC和CIK，来诱导培养DC、CIK 产生DC-CIK细胞，然后通过对比DC-CIK细胞和化疗药物顺铂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制效果，来探索一种更为有效的免疫治疗方法，为临床研究提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂 　　DMEM（Eagle medium and modified Eagle medium）（Gibco Invitrogen公司）；Fetal bovine serum（Gibco Invitrogen公司）；penicillin and streptomycin（Gibco Invitrogen公司）； trypsin 0.25% with EDTA（Gibco Invitrogen公司）；7.5% BSA（Gibco Invitrogen公司）；IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α及 CD3单抗（Cytolab公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 CIK细胞的诱导和扩增 取健康成年人外周全血30 mL，用等量Ficol1分离出PBMC。调细胞浓度为1×106/mL，置于37℃、5%CO2培养箱培养2h。收集非贴壁细胞，用含10%人AB血清的IMDM调细胞浓度为1×106/ml，并加人1000 U/mL的IFN-γ悬浮培养，24h后加入50ng/mL的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，每隔3 d半量换液1次，补充rhIL-2，调整细胞浓度始终为1×106/mL。在培养的第7 d，收获CIK细胞。然后加入新鲜DMEM完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。 　　1.2.2 DC的体外培养 在PBMC培养2 h之后的贴壁细胞中，加入含1000 U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4的GT-T551无血清培养液，37℃、5%CO2培养箱培养。每3 d换液1次并补充细胞因子，诱导单核细胞向DC细胞分化，在培养的第7 d，加入500U/mL重组人TNF-a，诱导DC细胞成熟；共培养到第9 d。收获DC细胞。 　　1.2.3 DC与CIK细胞共培养 将DE与CIK细胞混合，比例为DC：CIK=1：5，培养液为CIK培养液。无血清培养液中添加重组人IL-2 （300 U/mL）。 　　1.2.4 细胞传代培养 采用冻融法。消化收集对数生长期的MCF-7细胞，用PBS液离心洗涤2遍，再用PBS液重悬为1×107/mL，封装入冻存管。 　　1.2.5 DC-CIK作用于MCF-7 将MCF-7细胞稀释为5×105个细胞/mL的浓度，每孔100 μL加入96孔板培养24 h。将培养好的DC-CIK细胞，稀释为5×106 /mL及10×106 /mL的浓度，每孔100 μL加入到已经培养24 hMCF-7细胞的96孔板中，置于37℃ CO2