对流免疫电泳详解.ppt

对流免疫电泳 什么叫对流免疫电泳？ 对流免疫电泳定义 对流免疫电泳（counter immune electrophoresis）是免疫电泳技术中的一种，是一种免疫方法。还包括免疫电泳、火箭电泳等方法。 免疫电泳技术是将琼脂内电泳和凝胶内沉淀反应相结合的一种常用的免疫学方法。 实验目的 掌握对对流免疫电泳技术的原理和方法。 巩固电泳槽，电泳池的使用方法。 提高对抗原、抗体免疫反应的理解。 实验原理 在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高10～16倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白的定性和半定量测定。 实验特点 该法为一种定性实验，其应用双向琼脂扩散试验，其实际是在前者的基础上加电泳的方法，由于抗原抗体在电场下定向运动限制了抗原、抗体的扩散倾向，故能增加抗原、抗体的局部浓度及加快它们相遇的速度，从而提高试验的敏感性和缩短反应时间，有快速检测的特点。并且该方法成本低廉。 实验材料及试剂 1、正常人血清（抗原） 2、兔抗人血清（抗体），等电点：8.0 3、0.05U pH 8.6巴比妥-盐酸缓冲液、生理盐水 4、1%离子琼脂板（用0.05U 巴比妥-盐酸缓冲液配浇成） 5、打孔器，图样板，毛细吸管 6、电泳仪，电泳槽 实验方法 1. 制备离子琼脂板，按右图在琼脂板中打孔挑出孔中琼脂，孔径3mm，每组孔距3mm。 2.在正极的小孔加入已知抗人血清，靠近负极端小孔加入人血清，同时作生理盐水对照孔。 3.用毛细吸管按图滴加抗原、抗体。 4.加样完毕后，将琼脂板放入盛有0.05U pH8.6巴比妥-盐酸缓冲液的电泳槽内，用浸湿的滤纸片将离子琼脂板的两端与电泳槽内的缓冲液相接。 5.将电泳仪与电泳槽接通，开启后，调整电压为30V，电流强度为6~8mA，通电约1h。 6.取出琼脂板，在黑色背景处，多个角度观察结果。抗原与抗体间出现一条白色沉淀线为阳性。若沉淀线不清楚，于37℃环境中存放数小时可增强沉淀线清晰度。 实验流程图 观察结果 电压30V，电流强度6~8A，电泳1h ①孔加入兔抗人血清，②孔加入人血清，③孔加入生理盐水 制板 观察结果 断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电泳槽过夜再观察。 注意事项 1.加样时不要起泡，勿溢出琼脂孔。 2.抗原、抗体的量应相接近，如抗原过多，可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。 3.电泳时电压不宜过高或过低，过高可能会将琼脂拉断；过低时沉淀线出现的时间会延长。