SiRNA与RNAi实验技术题材.ppt

siRNA的获得—方法小结 比较项目 化学合成 体外转录 RNaseⅢ降解dsRNA siRNA表达载体 PCR表达框 需要条件 21-mer RNA片段 29-mer DNA片段 转录模板（200-800bp侧翼含有T7启动子） 55-60-mer DNA 片段 ~50-mer DNA片段 需要的时间 4天-2周 24小时加上DNA准备时间 1天加上转录模板准备时间 5天加上DNA准备时间 ~6小时加上DNA准备时间 工作量 少或无 中等 中等 多 中等 是否需要检测优化siRNA序列 需要 需要 需要 不需要 需要 可否进行标记（以分析转染效率和显微镜定位） 可以 可以 可以 不可以 不可以 转染的容易程度 好 好 好 差 差 可否筛选（即抗生素筛选） 不可以 不可以 不可以 可以 可以 可否用于长期研究 不可以 不可以 不可以 可以（抗生素筛选） 不可以 能否大规模合成 可以 受限 受限 可以 受限 能否检测群体的转染效率 不可以 不可以 不可以 可以 不可以 每个基因需要的费用（不包括劳力） 高 中等 低 中等 中等 siRNA的转染 1、磷酸钙共沉淀 将氯化钙，RNA（或DNA）和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含RNA（或DNA）且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-RNA或DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 siRNA的转染 2、电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。 siRNA的转染 3、DEAE-葡聚糖和聚凝胺 带正电的二乙胺基乙基纤维素（DEAE）-葡聚糖或聚凝胺多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透压差将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 siRNA的转染 4、机械法 转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。 siRNA的转染 5、阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。 siRNA的转染 为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1、纯化siRNA 2、避免RNA酶污染 3、健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 4、避免使用抗生素 5、选择合适的转染试剂 6、通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 7、通过标记siRNA来优化实验 RNAi的效果分析 RNAi分子水平的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。对于mRNA，可以采用 RT-PCR、荧光定量PCR或Northern杂交等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。由于生命的执行者是蛋白，因此还需要对蛋白水平进行检测，可通过Western杂交，ELISA，免疫荧光等。当然RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化。 siRNA实验成功的要点 对每个基因设计并检查两到四个siRNA序列 选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 避免RNA酶污染 健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 避免使用抗生素 选择好的转染试剂转染siRNA 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 通过阴性对照siRNA排除非特异行影响 通过标记siRNA来优化实验 RNA 操作时的注意事项与实验技巧 1、操作注意事项 1）如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。 2）操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌