新靶点CyclinE干扰RNA对人脑胶质瘤侵袭能力的影响.docVIP

新靶点CyclinE干扰RNA对人脑胶质瘤侵袭能力的影响 　　[摘要] 目的 构建人CyclinE新靶点的干扰RNA真核表达载体，观察CyclinE表达受抑制后的人脑胶质瘤细胞的侵袭能力的变化。 方法 构建4个新靶点CyclinE干扰RNA的真核表达载体后，用双酶切和碱基序列测定，转染载体到胶质瘤U251细胞株，将其分为U251组、PNC-U251组、PCyclinE-1-U251组、PCyclinE-2-U251组、PCyclinE-3-U251组、PCyclinE-4-U251组。通过RT-PCR的结果检测各组CyclinE mRNA的表达量，将干扰效果最好的一组用Transwell小室法检测侵袭能力的变化。 结果 成功构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4，而且CyclinE mRNA表达受到抑制，其中PCyclinE-1-U251组的穿膜细胞数为（45.4±2.7）个，U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数分别为（75.2±2.9）个和（74.4±3.5）个，U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数比较，差异无统计学意义（t = 1.23，P = 0.31），PCyclinE-1-U251组和U251组的穿膜细胞数比较，差异有统计学意义（t = 15.00，P = 0.00），PCyclinE-1-U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数比较，差异有统计学意义（t = 13.81，P = 0.00）。 结论 本实验构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体，PCyclinE-1-U251细胞侵袭能力减弱。 　　[关键词] 干扰RNA；细胞周期蛋白E；侵袭 　　[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（b）-0009-04 　　人脑胶质细胞瘤是人类中枢神经系统中最为常见的肿瘤之一，但是由于其侵袭性能力强，增殖速率快，导致预后极差[1]。尤其是胶质母细胞瘤，恶性程度最高，但是其发病机制目前仍不明确，而且没有像甲胎蛋白、人附睾蛋白、前列腺特异性抗原等常用且有效的肿瘤标志物[2-3]。正常的人脑胶质细胞和胶质瘤细胞的最大区别就在于许多和细胞周期调控的基因发生了改变，细胞周期蛋白E（CyclinE）就是其中之一。CyclinE在人脑胶质瘤中表达，与细胞周期蛋白质依赖激酶2（cyclin-dependent kinase，CDK2）结合促进pRB的磷酸化，并且和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子家族的基因结合在一起形成复合物，促进细胞周期从G1到S进程继续下去。CyclinE过量表达会使G1期缩短，导致细胞进入S期的时间提前，干扰细胞核核酸复制和分裂，导致肿瘤的形成[4-5]。因此，研究CyclinE表达的下调显得非常有意义，每个基因都不是单独存在并且发挥作用的，CyclinE也不例外其表达的下调会影响哪些基因的表达和功能还有待医学工作者去研究。干扰RNA技术能够特异的使基因沉默，近年已经作为一个常规实验应用于肿瘤基因学研究的多个领域。本研究利用RNA干扰技术设计并构建了新的CyclinE干扰RNA真核表达载体，采用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定Lipofectamine 2000转染成功构建的4个载体到胶质瘤细胞，通过检测转染后CyclinE mRNA表达量，筛选出沉默效果最好的一个载体，为后续在CyclinE沉默后用双向电泳技术研究蛋白质组学的变化以及用基因芯片技术研究转录水平变化奠定实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人脑胶质瘤U251细胞株购自中科院上海细胞库，DNA内切酶、DNA连接酶购自MBI公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自上海英骏公司，DNA凝胶回收试剂盒、琼脂糖等购自北京天根生化科技有限公司，Transwell小室购自Corning公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 实验分组 　　本实验将没有转染质粒的组定为U251组；将转染阴性对照质粒的组设为PNC-U251组；将转染PCyclinE-1质粒的组设为PCyclinE-1-U251组；将转染PCyclinE-2质粒的组设为PCyclinE-2-U251组；将转染PCyclinE-3质粒的组定为PCyclinE-3-U251组；将转染PCyclinE-4质粒的组定为PCyclinE-4-U251组。 　　1.2.2 新靶点CyclinE干扰RNA的构建 　　1.2.2.1干扰载体的靶序列 4对siRNA的靶序列即干扰部位为：PCyclinE-1：5-GGATGGTTCCATTTGCCATGG-3；PCyclinE-2：5-GC