3蛋白质3浅析.ppt

* 三、蛋白质的一级结构 思考题 什么是蛋白质一级结构和高级结构？ 蛋白质结构中有哪些化学键？ 3．一级结构测定的大致步骤有哪些？ 4．酶解多肽常用酶有哪几种？作用位点是什么？ 5．确定二硫键位置的方法有哪些？ * （一）、蛋白质结构的主要层次 一级结构 四级结构 二级结构 三级结构 primary structure 多肽链氨基酸序列 secondary structure 借助氢键排列成特有的α螺旋和β折叠片段等 Tertiary structure 借助各种非共价键 具有特定走向的紧密球状 quariernary structure 寡聚蛋白 超二级结构 结构域 supersecondary structure Structure doman * （二）蛋白质的一级结构 一级结构包括组成蛋白质的氨基酸数目、种类、排列顺序、多肽链数目，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。最重要的是多肽链中氨基酸的排列顺序，具有方向性 如何理解排列顺序的重要性？ 体现生物信息的多样性、空间结构的特异性， 包含决定蛋白质高级结构和生物功能的全部信息， 由核酸的遗传信息基因决定的，基因发生突变，将引起蛋白质氨基酸序列发生改变 * 1、蛋白质的一级结构：胰岛素的一级结构 2、测定蛋白质一级结构的要求 样品必需纯（97%以上） 确定蛋白质的分子量 确定蛋白质由几个亚基组成 确定蛋白质的氨基酸组成 并根据分子量计算每种氨基酸的个数 * 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一性裂解 末端氨基酸测定 二硫键拆开 纯蛋白质 3、蛋白质氨基酸顺序测定的方法 * 基本策略： 片段重叠法＋氨基酸顺序直测法 基本步骤： 测定蛋白质分子中多肽链数目； 拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链间、链内二硫键 分析每一条多肽链的氨基酸组成； 鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基； 裂解多肽链成较小的片段； 测定各肽段的氨基酸顺序； 片段重叠法重建完整多肽链一级结构； 确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。 4、蛋白质一级结构测定 * （1）测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质摩尔数之间的关系，即可确定多肽链的数目。 （2）拆分多肽链 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，分开多肽链(亚基). * （3）二硫键的断裂 （4）多肽N、C-末端氨基酸的测定 N端 Sanger法（二硝基氟苯DNFB反应）；DNS法（丹磺酰氯反应） Edman法（苯异硫氰酸脂反应） 氨肽酶法 C端 肼解法 还原法 羧肽酶法 * Sanger法: 在碱性条件下，DNFB与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-多肽）。 在酸性条件下，DNP-多肽易于水解为黄色DNP-氨基酸。通过乙醚抽提分离、色谱分析可以鉴定得到的不同DNP-氨基酸。 N端氨基酸测定（1）：二硝基氟苯（DNFB or FDNB）法 * 碱性条件下，DNS与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-多肽，然后水解，得到具有很强荧光的丹磺酰-氨基酸，检测灵敏度可以达到1?10-9 mol N端氨基酸测定（2）：丹磺酰氯法（dansyl chlorid,DNS法） * N端氨基酸测定（3）：Edman 化学降解法 N端氨基酸测定（4）：氨肽酶法 氨肽酶是肽链外切酶，能从多肽链N端逐个切下。 不同反应时间酶水解所释放出的氨基酸种类和数量不同，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 * 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。 肼化物与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 C端氨基酸测定（1）：肼 解 法 C端氨基酸测定（2）：羧肽酶法 从多肽链C-端逐个水解肽链，不同反应时间水解所释放出的氨基酸种类和数量不同，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。Y可作用于任一C-末端残基，现已被用来设计类似Edman序列仪的自动化方案 * （5）多肽链的部分裂解 化学法： 溴化氰法、羟胺法 酶解法： 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶 裂解（1） 溴化氰（CNBr）特异切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。肽链中甲硫氨酸数目较少，