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细菌内毒素定量检测的影响因素分析及对策 　　摘 要：当大量内毒素通过注射等方式进入血液时就会引起发热反应――“热原反应”。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。本文对细菌内毒素定量检测的影响因素进行分析并提出相应的对策。 　　关键词：细菌内毒素；定量；因素 　　细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热[1-5]。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖。细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，随着生物学，物理化学其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来[6-9]。当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，因此细菌内毒素广泛存在于自然界中。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但大量内毒素通过注射等方式进入血液时就会引起发热反应“热原反应”。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用[10-12]。本文对细菌内毒素定量检测的影响因素进行分析并提出相应的对策。 　　1 细菌内毒素结构构造 　　细胞壁较薄，结构也较复杂。肽聚糖含量低，肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。 　　1.1 蛋白质。脂蛋白（lipoprotein）由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。 　　1.2 外膜。外膜（outer membrane）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，其结构类似细胞膜，为磷脂双层。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。 　　1.3 脂多糖。脂多糖位于革兰氏阴性菌外膜外层。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸等组成。类脂A是脂化的葡萄胺二糖，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。 　　2 实验室应具备的条件 　　实验室必须具备以下条件；足够的清洁空间、内毒素检测系统、室内灭菌设施、百级净化工作台等。 　　3 试剂质量 　　3.1 鲎试剂灵敏度。在实际工作中，由于生产批号不同导致检测同一检品时用相同标示值的鲎试剂出现不同结果。为了保证检查结果的准确性，实验前应复核鲎试剂产品的灵敏度和自身凝集时间，必要时须对鲎试剂进行标化。 　　3.2 细菌内毒素标准品。细菌内毒素标准品是用世界卫生组织所提供的内毒素国际标准品来标定的。细菌内毒素标准品效价误差或效价不稳定均可影响实验结果。因此，应对细菌内毒素标准品的效价进行标定。 　　3.3 检测用水。中国药典规定稀释用的细菌内毒素检查用水应达到在（37±1）℃的条件下与0.03EU/ml鲎试剂混匀二十四小时内不产生凝集反应的标准。 　　4 试验器具 　　用于鲎试剂的器具必须满足以下条件：便于除热原，计量准确，使用、操作方便，对内毒素无吸附作用。稀释配制内毒素标准时，最好采用经硅烷化处理的无热原玻璃器皿。反应管也必须经清洗，250℃烘烤1h以上以彻底除热源。 　　5 受检样品中可能存在的干扰因素 　　5.1 多糖。l-3-β-D葡聚糖（10pg，Tn1）能激活鲎试剂旁路，常规的内毒素实验呈阳性。 　　5.2 蛋白质。阳离子蛋白如溶菌酶、核糖核酸酶A、人血白蛋白、球蛋白、人免疫球蛋白G、血红蛋白与LPS结合、抗凝血酶Ⅲ均可造成假阳性结果。 　　5.3 离子。高浓度的离子会引起内毒素的聚集，使内毒素不易解聚；当溶液中存在维生素、柠檬酸、肝素时可能干扰鲎试剂形成凝胶。 　　6 实验操作 　　6.1 操作熟练程度。实验操作的正确与否和熟练程度可对实验结果产生很大的影响。 　　6.1.1 鲎试剂的取用。取鲎试剂时，轻弹安瓿，使试剂粉末尽量落于安瓿底部，先用砂轮划痕，拭去玻璃粉末后用酒精灯消毒瓶颈，尽量避免异物掉入安瓿造成鲎试剂的污染。 　　6.1.2 鲎试剂的配制。用微量移液器配除热原枪头，按说明精确吸取所需量鲎试验检查用水。 　　6.13 内毒素标准品的配制。操作时必须准确稀释，使与鲎试剂反应的疏水基团充分暴露。 　　6.1.4 操作注意事项。双手避免在安瓿或试管上方来回移动，防止微生物的污染，并且操作过程中应避免气泡的产生。 　　6.2 混合液的pH值。样品液与鲎试剂混合液最适pH