细胞分子生物学技术.docVIP

1普通细胞化学与酶细胞化学区别与联系 细胞化学是研究细胞的化学成分，在不破坏细胞形态结构的状况下，用生化的和物理的技术对各种组分做定量的分析，研究其动态变化，了解细胞代谢过程中各种细胞组分的作用，是在细胞活动中的变化和定位的学科。 细胞化学是研究细胞的化学成分，及其在细胞活动中的变化和定位的学科。即在不破坏细胞形态结构的状况下，用生化的和物理的技术对各种组分做定量的分析，研究其动态变化，了解细胞代谢过程中各种细胞组分的作用。 细胞化学对酶的研究一般是将薄的冰冻切片用适宜的底物温育，然后来测定酶在细胞内的位置 酶细胞化学技术将细胞内的酶与底物相互作用， 再将酶反应的产物作为反应物质，在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物， 经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞化学反应。 酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程，孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉剂，保证孵育液pH的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织通过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋和超薄切片，至电镜下观察。 光镜样品： 固定（酶固定+结构固定）→ 冷冻切片 → 细胞化学反应 （酶反应+捕捉反应）→ 光镜观察 电镜样品： 固定（酶固定+结构固定）→切组织片→细胞化学反应 （酶反应+捕捉反应）→脱水包埋→ 超薄切片→电镜观察 如何实现一个人的基因在e.coli中的表达?简述其实验步骤?? 利用含有携带外源目的基因表达载体的E.coli表达菌株，通过向细菌培养基中加入化学试剂或是通过温度等条件的诱导（根据所构建的表达载体确定，不同载体构建中所用启动子不同，诱导表达方式也不一定相同），可使外源基因在E.coli中高效表达。 首先提取你要的目标的mRNA，然后做反转录PCR，设计引物的时候注意上游引物要包含启动子和下游引物要包含终止子，这样才能获得完整的编码序列。 然后你需要将你的反转录PCR产物进行序列测定，当然如果你这个是已知序列则可以不去测序，但你必须保证你有这个基因的完整开放可读框序列信息。接着，选择载体和宿主菌。你需要分析你要表达的基因的序列中含有哪些酶切位点和载体上的多克隆位点。然后，选择个内切酶，内切酶选择的要求有两个，一要是载体上多克隆位点有酶切位点的，二是你的序列中没有这两个酶的酶切位点。接着，就是人工在你的序列末端添加这两个酶的酶切位点，你需要重新设计引物，在原来第一次设计的引物基础上分别在上下游引物前面带上这两个酶切位点序列（上游一个，下游一个，不能随便加，你要查看多克隆位点的酶的排列顺序，上游引物前面加排在前面的酶切位点，下游引物加后面的）。加上酶切位点后还要在前面加上保护碱基，以确保内切酶能够完整的切出片段的酶切位点，保护碱基序列可以去查询相关内切酶的资料。接着用设计好的第二次引物使用第一次RT－PCR产物作为模板进行PCR扩增。得到的产物纯化后用选择的酶进行双酶切，同时也要对载体DNA用同样的两种内切酶进行双酶切。酶切结束后，分别纯化载体片段和PCR产物片段，然后进行连接。此时可以制作感受态细胞，连接结束后开始做转化。经过PCR筛选和双酶切鉴定得到阳性的菌株后，就可以进行液体培养诱导表达了。PET系统基本上都是用IPTG作为诱导物的，将阳性克隆接到含有相应抗性的液体LB培养基中37度培养3小时，然后加入0.1～1.0mM终浓度的IPTG，再培养4小时左右一般你就能拿到表达产物了。 真核基因在E.coli中表达实验步骤：①引物设计②目的基因总DNA提取③目的基因的PCR扩增④目的基因连接到克隆载体⑤重组质粒的酶切鉴定与序列分析⑥目的基因连接到表达载体⑦转化到E.colicen中表达⑧表达产物的免疫性分析 ??????? 基因组DNA提取和质粒DNA提取的异同点基因组DNA提取步骤 1. 从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2. 加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3. 取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4. 取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 质粒DNA提取一般用沸水浴法和碱裂解法，现在一般都采用碱裂解法，并有试剂盒可用，它主要是将细胞内的环状质粒提取出来，一般需要用SDS裂解，RNA酶降解，然后过柱，再进行洗脱。过程比较简单。而基因组DNA提取则较为复杂，也需要用SDS裂解和RND酶降解，但降解时间较长，同时对有些革兰氏阳性细菌