第四章 蛋白质的折叠的热力学与动力学.ppt

六、蛋白质的稳定性 1.研究意义和支撑技术 意义 为研究蛋白质的热力学定律提供理论基础 蛋白质医药、食品工程产业有巨大的应用前景 支撑技术 差异扫描量热法 定点突变 2.定义 蛋白质的稳定性是指作用力的净余额，它决定着一个蛋白是处于天然构象还是处于变性状态。 蛋白质的稳定性主要指蛋白质的物理上（热力学）的稳定性，而不是化学稳定性。 化学稳定性 化学稳定性主要指由于键的断裂而使结构的完整性丧失 天冬酰胺和谷胺酰胺的去氨基化 低pH值下精氨酸的水解 高温下蛋氨酸的氧化 二硫键的断裂 中性pH值下二硫键的交换 硫醇催化的二硫键的交换或者半胱氨酸残基的氧化 3.蛋白质的稳定性 蛋白质的稳定性即天然和变性状态下自由能的差。 DG = GN - GU = -RTlnK 天然态下自由能（ GN ）的减少和变性态下自由能（ GU ）的增加都会导致DG的减小 K = [N]/[U] = FN/(1- FN) 折叠状态的稳定性 单体蛋白折叠的稳定性一般在5 - 10 kcal/mol DG = GN - GU = -RTlnK K=e-DG/RT = e-10x1000/(2x298) =2x 10 7 室温下液体溶液中折叠状态的蛋白质和非折叠的蛋白质的比例是2x 10 7 : 1! 折叠状态的稳定性 K作为一个平衡常数，蛋白折叠的速度常数（kf）和蛋白去折叠的速度常数（ku）之比。 K=kf/ku 如果一个蛋白自发折叠的速度常数是1 s-1（kf = 1 s-1 ），那么这个蛋白自发去折叠的速度常数大约为10-7 s-1，半衰期大约为0.693/10-7 s = 80 days 表明去折叠的蛋白只是瞬间存在的 研究去折叠态就需要用urea, pH, etc等来打破平衡 4.打破折叠平衡的方法 极端pH使蛋白变性 变性剂 温度变性 4.1极端pH使蛋白变性 高pH或者低pH可以使大部分蛋白变性 大量离子进入蛋白质的内部而出现斥力减弱了疏水作用进而导致蛋白质的部分去折叠。 特异离子键的出现导致蛋白质处于一些紧密的中间态如熔球态。 4.2变性剂 蛋白质在变性剂溶液中的稳定性：SCN- Cl- Urea SO4 2- RNase: GuSCN = 0.3M, GuHCl = 0.8 M, urea = 3 M 打破疏水相互作用和氢键（支链和主链） 4.3温度变性 温度对蛋白结构的影响可以分为两种，热变性和冷失活。 温度变性主要影响是破坏氢键和增加疏水性。 5.研究稳定性的方法 一切可以区别折叠和去折叠状态的方法 光吸收 (e.g. Trp, Tyr) CD NMR DSC 尿素梯度电泳 – 通过 F 和 U状态下迁移率的改变 催化活性 6.支撑技术 差异扫描量热法 定点突变 热容量 系统在某一过程中，温度升高（或降低）1℃所吸收（或放出）的热量叫做这个系统在这个过程中的“热容量”。 热容量与温度变化有关，还与体系的状态转变有关，因此也与蛋白质折叠和去折叠相关。非折叠态的热容量要比折叠态的蛋白质的热容量要大。 Cp = H/T = TS/T 天然态和非天然态中水有序结构的转变导致了蛋白质热容量的改变。 6.1差示扫描量热法 量热实验：以恒定的速率加热两个量热池，一个量热池装蛋白质溶液，另一个量热池装缓冲液作对照，为了保持两个量热池的温度相等分别加热，它们热量需求的差别就是两个池中热容量的差别。 差示扫描量热法(differential scanning calorimetry;DSC) 是一种热分析法。在程序控制温度下，测量输入到试样和参比物的功率差（如以热的形式）与温度的关系。差示扫描量热仪记录到的曲线称DSC曲线，可以测定多种热力学和动力学参数。 差异扫描量热法 (DSC) DSC measures the heat required to raise the temperature of the solution of macromolecules relative to that required to the buffer alone . DSC can be used to directly measure the enthalpy and melting temperature of a thermally induced transition. At Tm (50% unfolded), DG = 0, DH = TDS Van‘t Hoff焓 DG = GN - GU = -RTlnK DG =DH -T D S -RTlnK =DH -T D S lnK = (- DH/R)(1/T)+ D S/R y=mx+b Van‘t Hoff 曲线 (lnK vs. 1/T)可以从平