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基本原理 比色法和分光光度法的定量依据是比尔-朗泊 Beer-Lambert 定律，简称比尔定律。这个定律是通过实验观察发现的。当一束平行单色光通过一定液层厚度的有色溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就会减弱。溶液浓度越大，通过的液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的越多，光强度的减弱也越显著。描述这种定量关系的正是比尔-朗泊定律，即溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比，用下式表示为： A E×C×L 2-20 式中 A一吸光度 E一吸光系数 L—溶液层的厚度 C—溶液的浓度 E是各种物质在一定波长下的特征常数，它可衡量物质对光吸收的灵敏程度。E值越大，表示该物质对此波长的光吸收能力越强。 比尔定律不仅适用于有色溶液，也适用于其它均匀、非散射的吸光物质 包括液体、气体和固体 ，是各类分光光度法的定量依据。 通常当光线透过溶液介质时，会被分成三部分，即在介质表面分散或反射的光（称为反射光，用I1表示）、被介质吸收的光（称为吸收光，用I2表示）和可以通过介质的光（称为透射光，用I3表示）。因此，入射光（I） 反射光（I1）+吸收光（I2）+透射光（I3）。如果以蒸馏水作为空白来校正反射光，则I1被抵消，于是 I I2+I3。一般将经过空白校正后的入射光强度用I0表示，透射光强度用I表示。 在吸光度的测量中，有时也用透光度T或百分透光度%T表示物质对光的吸收程度和进行计算。透光度T是透射光强度I与入射光强度I0之比，即： T I/ I0 若以吸光度A对物质的浓度作图，则得图2-10中的直线。但若以透光度T对吸收物质的浓度作图，则得图2-11所示的曲线图。 图2-10 吸光度与溶液浓度的关系 图2-11透光度与溶液浓度的关系 比色法 如前所述，有色物质可用其颜色的深浅来测定其含量。但很多物质在可见光区域的吸光系数是很小的，不能直接用比色法或分光光度法。 某些物质在与有些试剂进行反应后，形成的有色产物在可见光区域的吸光系数很大。这就成为利用比色法定量测定某些物质的理论基础。在特定的实验条件下，当待测物与一定量的显色剂反应后，则形成有色化合物。在一定波长范围内，这些有色化合物的量是与原来无色化合物的量成正比的。但由于用比色法进行分析时，颜色的形成是化学反应的结果，因此，在比色反应中应将待测物质以外的其它全部试剂做空白对照，并由此来调整仪器的吸光为零。在这种条件下，依据所测得的物质的吸光值与其相应的已知含量或浓度可绘出标准曲线图 图2-12 。 图2-12 标准曲线示意图 如果严格符合比尔定律，应该获得一条通过原点的直线。用同样的方法测出样品的吸光值，就可以方便地从这条标准曲线上查出对应的测定样品的浓度。该法的灵敏度较高，目前在定量测定方面的应用很广。但使用此法进行测定时需要注意以下几点。 ①因为任何有色溶液都只对一定的单色光有强烈的吸收能力，并且溶液呈现的颜色是与其吸收的单色光互补的，所以必须选用被测溶液吸收最强的单色光 波长 ，才能得到较满意的结果。波长与颜色的关系见表2-l 。 表 2-1 几种主要颜色在光谱中的位置 颜色 紫 蓝 青 绿 黄 橙 红 波长/nm 400～440 440～480 480～490 490～550 550～590 590～630 630～780 ②应将除待测物质以外的全部试剂溶液作为空白对照。 ③制作标准曲线是至少5个实验点以上，每点要有重复实验值。所有的实验点都应分布在标准曲线上或其附近。 ④样品及标准品浓度不要过高，一般在吸光值0.2～0.6之间。因为这样才符合比尔定律。 ⑤对于精确的定量测定，未知样品测定应与标准曲线的制作同时进行。 ⑥操作要认真仔细，器具要干净。 分光光度法 与上述比色法相比，某些物质 如蛋白质、酶和核酸等 在紫外光谱区有最大的光吸收，不需进行颜色反应即可直接用紫外分光光度计测定。其依据依然是比尔定律。此法快速、方便，但灵敏度不如比色法。 蛋白质在280nm处有最大的吸光值，但此值的高低是随着蛋白质中酪氨酸、色氨酸的含量多少而变化的。因此同样浓度不同类型的蛋白质在280nm 处有不同的吸光值。在一定条件下，蛋白质的吸光系数是一个恒定值。如测出已知浓度的蛋白质溶液的吸光值，即可根据式 2-20 计算出其吸光系数。 利用紫外分光光度法对单一组分的物质或两个组分组成的混合物 两者的吸收峰是完全独立的 进行定量分析是适宜的，但对于存在某些干扰杂质的样品，则需校正。如蛋白质中核酸的校正即可用 280nm/260nm的吸光度比值来校正（表2-2），这样即可确定蛋白质的实际含量。 表 2-2 紫外分光光度法测定蛋白质含量的校正数据表 280nm/260nm 核酶/% 校正因子 280nm/260nm 核酶/% 校正因子 1.75 1.63 1.52 1.40 1.36