引物设计Oligo.ppt

?G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的?G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。 Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。 blast验证引物 进入网页：/BLAST/ * * 单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口 出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq 点击“window”再点击“Tile” 出现Primer pairs窗口，＃代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量 点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息。 关掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原来的窗口，就能看到引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列。 至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等。 当上下游引物全选好以后，首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。 在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： 注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’; 5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’ 简便的做法是同时输入上下游引物。输入上下游引物系列都从5’— 3’。 输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物，如下图： 在Choose Search Set栏中： Database根据预操作基因的种属定了，本引物可选Human genomic + transcript或Others (nr etc.)。 点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项 在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图： 在Choose Search Set栏中： Database根据预操作基因的种属定了，本引物可选Human genomic + transcript或Others (nr etc.)。 在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图： 在此界面最下面 关键要点击Algorithm parameters参数设置，进入参数设置界面。 在General Parameters中：Expect thresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size的下拉框将数字改为7。如下图： *