环境水中细菌种类分布及耐药性研究.docVIP

环境水中细菌种类分布及耐药性研究 摘要：目的 了解环境水中细菌的种类、分布及其耐药性。 方法 无菌采集环境水,增菌后分离、鉴定细菌,K-B法和MIC法测定分离菌对药物的敏感性，PCR法检测耐药基因。 结果 从***市环境水中分离出150株细菌，其中弧菌78株，肠杆菌33株，非发酵菌28株，微球菌5株，葡萄球菌5株，链球1株。医院分离得到菌种50株，养殖场分离得到菌种27株，生活区分离得到菌种73株。弧菌对头孢唑林耐药率最高为46.15%，肠杆菌对四环素、头孢唑林耐药率较高为24.24%，非发酵菌对氨曲南耐药率最高为35.71%。生活区周边环境水分离菌头孢唑林耐药率最高为33.78%，其次为庆大霉素14.86%；医院周边环境水分离菌头孢唑林耐药率最高，为26.0%，其次为氯霉素18.0%；养殖场周边环境水分离菌四环素耐药率最高，为29.62%，其次为头孢唑林22.2%。弧菌科生活区周边环境水分离菌耐药率最高为61.36%，肠杆菌科中医院周边和养殖场环境水分离菌耐药率最高，为66.67%；非发酵菌科中医院周边环境水分离菌多重耐药率最高，为60.00%。肠杆菌中有4株产ESBLs，携带有TEM、SHV、CTX-M9型耐药基因，未检出CTX-M1，CTX-M2，CTX-M8及VEB基因。10株碳青霉烯酶耐药非发酵菌OXA-24基因携带率为10.00%(1/10),OXA-51基因携带率为20.00%(2/10),SHV基因携带率为20.00%(2/10),未检测到TEM、OXA-23、OXA-58基因。对庆大霉素耐药的菌株55.6%(10/18)携带有ant(3’’)-I基因，44.4%(8/18)携带有aac(6’)-I基因，27.8%(5/18)携带有aac(3)-I基因，未检测到aac(3’)-II基因。结论 ***市环境水中细菌种类多，携带的耐药基因型繁多。 关键词：环境水；耐药性；细菌种类及分布；超广谱β内酰胺酶 环境水体中细菌种类繁多，与人类生活密切相关，不仅水中的微生物可来源于人类的各种活动，人也可因多种活动而接触水中的微生物甚至感染，如经口进入人体，引起腹泻、食物中毒等肠道感染性疾病；经破损皮肤黏膜侵入，引起伤口感染等[1]。另外沙门菌、志贺菌及霍乱弧菌都可经由水传播，引起传染病的暴发流行。但自1942年Ramel-kamp和Maxon首次报道对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌以来，人们开始认识到并逐步重视细菌的耐药性。耐药菌的出现增加了感染性疾病治愈的难度，其治疗成为世界性关注的问题，对其耐药情况分析具有重要意义。本实验调查研究环境水中细菌耐药情况及耐药基因携带情况，了解菌株耐药性的演变和耐药基因分布，为从源头解决细菌耐药问题提供可靠依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1标本采集及处理 2015年7月—2015年9月对医疗单位周边、居民生活区、畜牧或水产养殖场周边不同类型的环境水进行采样。每个采样点采集500ml样品，记录采样点数据，水样4h内立即送检。 1.1.2试剂和仪器 台式高速冷冻离心机(艾本德中国)；电热恒温水槽(上海一恒)；隔水式恒温培养箱(上海森信)；LifePro基因扩增仪(杭州博日)。Gel Doc XR+型凝胶成像系统(美国伯乐)。 1.2方法 1.2.1细菌分离 水样加入LB液体培养基，37℃，180rpm，18~24h，四区划线接种于血琼脂培养基，37℃培养18~24小时，观察并记录细菌生长情况，挑取不同形态的菌落接种于新血琼脂培养基分离培养。 1.2.2细菌鉴定 对分离得到的菌株从形态、培养特性及生化反应特征等方面进行鉴定[2-4]；对于较难鉴定或生化特性不明显的分离菌，提取细菌基因组DNA，测序比对确定细菌属种。 1.2.3超广谱β内酰胺酶(ESBL)的检测[5] 对于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌，应贴上头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松(每片含量均为30μg)药敏纸片，贴好纸片的MH平板培养基置于35℃环境下，孵育16~18h后测量抑菌圈直径，凡头孢泊肟或头孢他啶的抑菌环直径≤22mm,头孢曲松≤25mm,氨曲南或头孢噻肟≤27mm,均应高度怀疑为ESBLs菌株，应进一步作确认试验[6]。任何一组加克拉维酸的药物比相应的不加克拉维酸的抑菌环直径增大≥5mm时，即可判定为ESBLs菌株[7]。 1.2.4药敏试验 采用Kirby—Bauer纸片法和微量肉汤稀释法测定细菌对抗菌药物的敏感性，试验结果判断参照CLSI/NCCLS(2014版)标准。 1.2.5细菌耐药基因检测 BLA基因检测[8-9] TEM、SHV、OXA、CTX、aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6’)-I、ant(3’’)-I 基因的PCR。PCR体系为反应体系为25μl