2011年基因程大实验讲义.docVIP

各位同学： 本学期的植物基因工程实验定于第十一周的周一至周六（10.31-11.5日）在综合楼513室进行。望各位同学提前打印好实验讲义，并在每次实验之前对相应实验内容做好充分预习。 （实验讲义内容及日程安排见网络教学平台。 用户名2009chenshihua 密码：123 具体实验试验内容如下： 大实验一 目的基因的克隆（共计8学时） 实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA实验二 反转录PCR实验PCR扩增（中间穿插准备下次实验相关材料）（4学时） 大实验二 表达载体的构建（共计24学时） 实验一 琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增基因产物的回收及重组载体的构建 （4学时） 实验二 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法） （4学时） 实验三 质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选（4学时） 实验四 质粒（碱法）提取及电泳检测 （4学时） 实验五 重组载体（质粒）的酶切和电泳检测 （4学时） 大实验三 目的基因的遗传转化及分子筛选/检测（共计16学时） 实验一 植物转基因操作：渗透法转化拟南芥及转化子筛选 （4学时） 实验植物基因组DNA的提取实验 转基因植物β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物（4学时） 基因工程综合实验具体日程安排： 周一上午： 总RNATrizol试剂快速提取 RNA电泳检测及反转录PCRPCR扩增（中间穿插准备后面实验用的LB培养基） 周二下午： 琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR扩增基因产物及重组载体的构建 周三上午： 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法） 周三下午： 质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选 周四上午： 植物基因组DNA的提取转基因植物β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物 目录 实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA实验二 反转录PCR（RT-PCR）DNA） 实验四 从琼脂糖凝胶中回收（PCR 产物）DNA片段 实验五 DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA） 实验六 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测 实验七 质粒转化 实验八、九 质粒（碱法）提取及重组质粒（重组子）的筛选和酶切检测 实验十 渗透法转化拟南芥及转化子筛选 实验 植物基因组DNA的提取及转基因植物PCR检测 实验 转基因植物 实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA 实验目的 学习用试剂盒从植物组织中提取总RNA的方法。 实验原理 RNA是一类极易降解的分子，要获得完整的RNA必须在提取过程中最大限度地抑制内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解作用。高强度变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA，蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA，LiCl可以选择性的沉淀RNA，使RNA进一步得到纯化。TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。RNase。 抑制RNase的活性：准备溶液时使用无RNase的玻璃器皿、DEPC 处理过的水。180-300℃烘烤玻璃器皿4小时。用DEPC或其他商业化产品处理塑料制品。 尽量使用无RNase的一次性移液器头和微量离心管。在从原包装取出这些小器具时最好使用无菌的镊子！ 在分离RNA的过程中用抑制剂抑制RNase的活性。 实验仪器、材料与试剂 （一）仪器 低温离心机 200℃以上烘箱 琼脂糖凝胶电泳系统 紫外线透射仪 高压灭菌锅 恒温水浴锅 陶瓷研钵 微量移液器 （二）材料 新鲜植物组织 ml Eppendorf 离心管 剪刀、一次性手套等 试剂 Trizol试剂 氯仿 异丙醇 70%乙醇 焦碳酸二乙酯（DEPC） 实验步骤 称取00mg新鲜植物植株，液氮研磨成粉末移入DEPC处理并灭菌的1.5 ml Eppendorf离心管。 加入1ml Trizol 试剂， 充分混匀。 15~30℃，5min。 4℃，13000rpm,10min。 取上