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应用percoll密度梯度离心分离百合花粉的研究 　　摘要 以东方百合商业品种Viviana的花粉为材料，应用percoll密度梯度离心分离百合花粉，得到了4个分层，第1、2层花粉体积较小，第3、4层花粉较大，但每一层中都观察到了直径在150 μm以上的球形花粉，1、2层数量较少，3、4层数量较多。离心后的花粉分别置于培养基上培养，观察到花粉萌发率较低。 　　关键词 百合花粉；percoll；密度梯度；离心；分离；花粉萌发 　　中图分类号 Q944.42 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）19-0162-02 　　百合为百合科百合属植物，其商业品种是世界市场最重要的切花之一，受到广泛欢迎。未减数花粉即花粉的倍性与植株倍性相等，一般是由于植株减数分裂异常产生的，在百合杂交品种中比较常见，这些品种通常染色体同源性较差，减数分裂进行联会时容易失败，产生的未减数花粉有些能够正常萌发，可以用于杂交授粉。百合未减数花粉通常体积明显大于正常花粉，相别于椭圆形的正常花粉，未减数花粉通常是球形的。 　　percoll分层液对细胞无毒性，流动性差，黏性低，渗透压均匀，适合于细胞分离等试验，应用广泛[1-3]。1983年黄大年利用percoll进行小麦、烟草等植物花粉的分离，取得了很好的效果。本试验学习了前人的经验，将percoll应用于百合花粉的分离，并总结了试验相关情况。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　试验材料为百合商业品种Viviana，种植于贵州省园艺研究所花卉园区内，Viviana为二倍体O系百合杂交种，其产生的花粉经流式细胞仪检测后确认有二倍体花粉存在。 　　1.2 试验方法 　　离心方法完全仿照了黄大年等分离烟草花粉的方法，通过percoll密度梯度离心将Viviana花粉进行分层并分别抽取出来，观察每层花粉的体积及花粉萌发情况[4-6]。 　　分离样品制备：将大量Viviana花粉置于6 cm培养皿中，加入2 mL 0.25 mol/L的蔗糖溶液搅拌均匀后倾斜静置沉淀10 min，用移液枪尽量抽取底部沉淀花粉后，存放于2 mL离心管待用。 　　不连续percoll密度工作液制备：按体积比9∶1混合percoll和2.5 mol/L蔗糖溶液，配置成等渗percoll母液（PIS），将此母液按不同比例与0.25 mol/L蔗糖溶液混合成工作液（表1）。 　　使用注射器在15 mL离心管内铺设不连续梯度，共5层，每层2 mL，由高密度到低密度依次叠加。将1 mL制备好的花粉悬浮液加入最上层，700 r/min离心20 min。将分层的花粉依次抽出，分别放入15 mL离心管内。加入10 mL的0.25 mol/L蔗糖溶液到各个离心管中，700 r/min离心5 min，收集底层花粉。将花粉铺设在培养基上，观察每层花粉的体积，并观察花粉萌发情况[7-8]。培养基配方：100 g/L蔗糖，5 g/L琼脂，20 mg/L硼酸。 　　2 结果与分析 　　2.1 离心效果 　　离心后得到的花粉见图1，从图1可以明显看到花粉分为不连续的4层，将花粉依次抽出后观察体积（图2～5），图中标尺为200 μm。第1层花粉的体积较小，其中很多为干瘪的，饱满花粉大多数长径不到100 μm，圆形花粉较多，体积普遍偏小，观察到1粒直径150 μm以上的球形花粉，整体颜色较浅，边缘透明（图2）。第2层花粉普遍较第1层体积大，椭圆形花粉较多，干瘪花粉较多，能观察到长径接近200 μm的椭圆形大花粉粒，也有150 μm以上的球形花粉，但较为稀少（图3）。第3层花粉依然有大量干瘪花粉，有大量直径在150 μm以上的球形花粉，颜色深黑，透光性差，明显大于百合一般的椭圆形花粉，判断为未减数花粉（图4）。第4层花粉体积更大，观察到直径接近200 μm的巨型花粉1粒，大量花粉是直径在150 μm以上的球形花粉，颜色深黑，透光性差（图5）。综合来看，通过不同密度梯度离心，可以对百合花粉进行较为粗疏的分离，密度的差异将花粉分离开来，但并不足以准确地区分单倍体花粉和未减数花粉，究其原因，虽然2 n花粉内部物质含量高，但是体积也相对更大，并未造成显著的密度增大，但是相对于未经过离心分离的花粉，第3、4层的未减数花粉含量已经大大增加。每层花粉随机取10个视野，统计观察到150 μm以上球型花粉的概率见表2。 　　2.2 花粉萌发状况观察 　　离心后的每层花粉分别撒在培养基上，观察萌发状况。正常的Viviana花粉在撒到培养基上之后，大约30 min开始萌发，大多数花粉在2 h后都能长出花粉管。离心后的花粉则要慢得多，24 h后才能看到花粉萌发，并且萌发率偏低，远远不如未经处理的花粉。第2、3层的萌发情况略好，第1