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银杏叶片愈伤组织诱导的激素组合培养条件分析 　　摘要：以银杏（Ginkgo biloba L.）叶片外植体为试材，研究了不同激素组合培养条件对银杏叶片外植体脱分化诱导愈伤组织的效果。结果表明，不同激素组合培养条件对银杏叶片外植体启动脱分化（膨大）的效应极显著，且膨大率与膨大速度之间具有良好的一致性；不同培养条件对银杏叶片外植体愈伤组织诱导形成的效应极显著，且愈伤组织的诱导率与诱导速度之间具有较好的协同性；综合各项测量指标，当培养基中激素组合为MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT时，银杏叶片诱导愈伤组织诱导效果相对最佳。 　　关键词：银杏（Ginkgo biloba L.）；叶片；膨大；愈伤诱导；培养条件 　　中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0216-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.057 　　银杏（Ginkgo biloba L.）为银杏科银杏属落叶乔木，又名白果、公孙树、鸭脚树、蒲扇，是新生代第四纪冰川期的孑遗植物，素有裸子植物“活化石”之称，为中国独存的珍稀名贵树种[1]。银杏叶中含有黄酮类化合物和萜内酯类化合物等多种生理活性物质，具有扩张血管、增加血流量、改善血液循环、降低脑血管阻力、抑制血栓形成、改善脑细胞代谢水平等作用[2-4]，已经在食品、保健、医药等领域得到广泛开发利用。目前，利用银杏愈伤组织的细胞悬浮培养生产黄酮类次生代谢产物成为近年来发展的新领域[5-7]，但是由于银杏初始愈伤组织的品质与特性差异，往往造成生产量偏低，很难满足工业化生产的需要。目前，许多研究者从不同侧面探索银杏离体培养中培养基类型、激素、培养条件及其他相关因素对银杏愈伤诱导的影响[8-11]。本研究以银杏叶片为试材，以2，4-D、NAA、6-BA与KT 4种激素为效应变量，分析不同激素组合培养条件对银杏叶片外植体启动脱分化与愈伤诱导的效应方式与效应大小，为进一步优化银杏愈伤组织培养条件，提高银杏愈伤组织诱导效率，促进其大规模细胞悬浮培养生产有效次生代谢产物提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　取陕西理工学院校园内一株约10年生银杏树干萌发的幼嫩枝条上的新鲜叶片作为试验材料。试验用NAA（α-奈乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、2， 4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）与KT（呋喃氨基嘌呤）均为分析纯；培养基为MS培养基。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 试验材料预处理 选择颜色鲜绿、完整健康、大小一致的银杏叶片，用纱布擦掉表面灰尘，然后用自来水冲洗表面的杂质1～2 h，在超净工作台采用乙醇-升汞配合消毒。将试材装入消毒好的广口瓶中，首先用75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡10 min，处理过程中不断摇动，保证消毒液与叶片充分接触，然后用无菌蒸馏水冲洗5～6次，每次2～3 min，放置于无菌滤纸上吸干水分。无菌操作条件下用解剖刀将银杏叶片切分为长宽约0.5 cm的小块，接种至不同组合的诱导培养基。 　　1.2.2 培养基配制 在MS培养基中加入不同剂量的NAA、6-BA、2，4-D与KT 4种激素，配制成试验所需的培养基（表1），各培养基中均按3.0%的浓度加入蔗糖，按0.6%的浓度加入琼脂粉，调整pH为5.8～6.0，在121 ℃、1.3～1.5大气压下灭菌20 min，备用。 　　1.2.3 材料处理与诱导 无菌操作条件下，将预先准备好的银杏叶片外植体，分别接种至Ⅰ～Ⅸ培养基中，放置于温度（25±2） ℃，相对湿度50%～60%，黑暗培养30 d，观察愈伤组织的形态、颜色、质地及生长情况，定期统计各处理中体积明显膨大的外植体数与诱导出愈的外植体数，并依此计算出相应的二级变量。 　　1.2.4 数据统计与分析 接种10 d后，去除污染与坏死材料，统计无菌外植体数，视为接种外植体总数。依据定期统计的膨大数、出愈数计算出膨大率、膨大速度、诱导率与诱导速度。计算公式如下： 　　膨大率=膨大外植体数/接种外植体总数×100% 　　膨大速度=（WN-WM）/[（N-M）×Y] 　　诱导率=诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100% 　　诱导速度=（ZN-ZM）/[（N-M）×K] 　　式中，WN代表第N天膨大的外植体数，WM代表第M天膨大的外植体数，K代表接种外植体总数，ZN代表第N天出愈的外植体数，ZM代表第M天出愈的外植体数。 　　采用SPSS 19.0统计软件，对试验数据进行one-way ANOVA分析，研究不同培养条件对银杏叶片愈伤组织诱导的效应