陆地棉棉酚合成关键基因杜松烯合酶基因克隆及序列差异分析.docVIP

陆地棉棉酚合成关键基因杜松烯合酶基因克隆及序列差异分析 摘要：利用同源克隆法克隆获得有酚陆地棉（Gossypium hirsutum）杜松烯合酶（Delta-cadinene sythase） 基因。结果表明，该基因长ORF为1 665 bp，编码551个氨基酸，具有类戊二烯的保守结构域，有酚和低酚陆地棉之间，该基因存在序列差异。 关键词：陆地棉（Gossypium hirsutum）；杜松烯合酶；克隆；差异序列 中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2114-03 DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.08.051 Abstract： The gene named Delta-cadinene sythase in this study was obtained from using homology-based cloning method for cloning. The results showed that this gene contained an ORF of 1 665 bp in length encoding 551 amino acids with the conservative domain structure of class pentadiene.Between low phenol and phenolic G. hirsutum， the gene exist sequences of differences. Key words： Gossypium hirsutum； Delta-cadinene sythase； clone； sequence of variance 棉花是重要的经济作物，不仅是优质天然纤维的主要来源，而且种子中含有极为丰富的蛋白质。棉子蛋白是优质的蛋白质原料，可以提高动物生产性能，降低饲料成本[1]。中国每年有1 000万t以上的棉子，年产棉子饼、粕达600万t以上[2]。根据资料中国棉花棉子蛋白质含量为22%～24%[3]，是世界上仅次于大豆的重要植物蛋白质资源。目前全球大面积栽培的棉花品种主要是陆地棉（Gossypium hirsutum），其种仁含有棉酚及其衍生物，人及非反刍动物食用后会出现中毒现象，轻则头晕、呕吐，重则引起死亡。通过选育无腺体性状已获得无酚或低酚棉花品种，并已取得卓越成效，实践证明采取控制腺体性状来控制棉酚是很有效的策略[4]。然而从分子生物学角度，如何调控棉酚，探索棉酚与腺体之间的关系，达到有效控制棉酚和腺体，这都是亟待解决的问题。棉酚是倍半萜次生代谢物质，其生物合成代谢是异戊二烯途径，其中倍半萜环化酶―杜松烯合酶（Delta-cadinene sythase）是该途径的关键酶之一[5，6]。本研究拟采用同源克隆结合棉花D基因组序列克隆陆地棉参与棉酚合成的关键酶，为弄清棉酚与腺体形成的机制奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料及处理 棉花幼苗采用无菌培养。精选大小均匀、无病虫害的棉花种子，用0.1%的升汞消毒8 min，蒸馏水冲洗干净，种植于装有MS培养基的锥形瓶中。培养室温度控制在昼温25 ℃，夜温20 ℃，光照周期12 h，光照度5 000 lx。 待棉花幼苗子叶完全展开时，选取生长健壮、大小均匀一致的植株进行取样。称取0.1 g用0.1% DEPC水冲洗干净，在液氮中充分研磨后置于-70 ℃冰箱保存备用。 1.2 总RNA的提取与cDNA的合成 取保存的样品，采用EASYspin RNA快速提取试剂盒（重庆波尔公司）提取总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。采用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶（1.2%）电泳检测RNA的质量。采用ReverTra Are qPCR RT Master Mix with gDNA Remover （TOYOBO）试剂盒，按照试剂盒说明书操作合成第一链cDNA，用于基因克隆。 1.3 种子序列及基因全长的获得 1）利用已经发表的其他物种上相关基因的序列，采用Blast程序在NCBI网站进行棉花EST数据库比对，寻找出高度同源的序列，将同源序列进行拼接组装成重叠群（Contig）。 2）以重叠群为种子序列，再次Blast检索棉花的EST数据库和序列组装，延伸重叠序列，重复上述过程，直至没有新的EST检出即重叠群序列不再延伸，从而生成最终的最长新生序列。将新获得的种子序列与公共数据库棉花D基因组比对，找到该序列对应的基因全长，以该全长序列为参考设计引物，以陆地棉cDNA为模版扩增，并通过测序获得目的基因全长序列。 1.4 目的基因的PCR扩增 以上述反转录得到的棉花cDNA为模版，进行PCR扩增。PCR扩增程序为