多管发酵法步骤和材料清单.docVIP

多管发酵法测定大肠杆菌 实验器材及药品： 序号 实验用品（按取2个水样） 数量 试管（带试管塞） 40支 小倒管 35个 试管架 2个 10ml量筒 1个 10ml移液管 2个 吸耳球 2个 1ml移液管 8个 接种环 1个 酒精灯 1个 恒温箱 1个 蛋白胨培养液 1瓶 EC培养液 1瓶 电炉 1个 500ml 烧杯 4个 玻璃棒（搅拌用） 2个 取样瓶 2个 标签纸和记号笔 1个 电子天平，取样勺 1个 高压灭菌锅 1个 蒸馏水 1桶 洗瓶 1个 冰箱（如果水样和培养基不用长时间放置，可以不用） 1个 恒温水浴锅 1个 其它实验辅材 若干 实验步骤 2.1 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表1。 表1 接种用水量参考表 如接种体积为10ml则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml;如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。 2.2 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 2.3 复发酵试验 轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。 结果的计算 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2 或表3 中查得每升水样中的粪大肠菌群。 接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表2 可得每升水样中的粪大肠菌群； 接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表3 求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。 如果接种的水样不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表3 求得MPN 值，再经下式计算成每100mL 的MPN 值。 附：（两种培养基也可以直接购买） 单倍乳糖蛋白胨培养液成分；10g蛋白胨，3g牛肉浸膏，5g乳糖，5g氯化钠， 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，1000ml蒸馏水。配置时调节pH：7.2—7.4 EC培养液成分：20g胰胨，5g乳糖，1.5g胆盐三号，4g磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾，5g氯化钠，1000ml蒸馏水。灭菌后pH为6.9.