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BCL-2 ISH Detection Kit BCL-2原位杂交检测试剂盒 使用说明书 产品编号：MK1050 保存：置４℃。 工作量：100张切片。 有效期：一年。 BCL-2是主要的抗凋亡基因。本试剂盒采用针对人、大鼠、小鼠的BCL-2特异性的寡核苷酸探针，经地高辛标记。 由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法，具有敏感性特别高，背景清晰，结果准确可靠的优点。可以检测出常规福尔马林固定，石蜡包埋标本的BCL-2 mRNA序列。针对人BCL-2靶基因的mRNA序列为： 5’——GATGA AGTAC ATCCA TTATA AGCTG TCGCA——3’； 5’——GCGCT CAGCC CGGTG CCACC TGTGG TCCAC——3’； 5’——GGGAG ATGTC GCCCC TGGTG GACAA CATCG——3’； 大鼠、小鼠和人的序列仅3bp/90bp不同。兔和人序列基本相同。 适用种属：人、大鼠、兔、小鼠组织。 试剂盒中内容 1.胃蛋白酶（×10; Pepsin）2ml； . 预杂交液 2ml；. BCL-2寡核苷酸探针杂交液 2ml； . 封闭液 5ml; 5.生物素化鼠抗地高辛 5ml; 6. SABC-POD 5ml；. 生物素化过氧化物酶 5ml。 `用户自备试剂：原位杂交专用盖玻片（博士德有售）；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油 缓冲液（3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC， 原位杂交用 PBS ） 一．培养细胞和冰冻切片 准备工作： 固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6）；1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6） 3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7·H2O）3g,PH2.0左右。 2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。 0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。 0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。 20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。 原位杂交用PBS——0.02M phosphate ；0.5M NaCl 1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4·12H2O 6g, NaH2PO4·2H2O 0.4g ,PH7.2-7.6。 操作程序： 注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。 2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为 Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS PH7.4 洗2分钟×3次。 3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。 4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。 5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。 6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。 7. 预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。 8. 杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜 根据杂交情况可以调节 。 9. 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次 如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次 。.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗 11.滴加生物素化鼠抗地高辛： 37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。 12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。 13.