AQP1基因沉默2014.docVIP

小鼠肾近端小管吸收特定的壳聚糖/小干扰RNA纳米颗粒使AQP1基因沉默 摘要：以RNA为基础的治疗方案为包括肾脏疾病在内的许多人类疾病提供了一个具有很大治疗潜力的治疗方案，但是在实验中面临着许多特殊和多样目的的挑战。壳聚糖多样系统之前被显示以siRNA为目标，尤其是在针对小鼠肾脏进行的实验中。我们通过2D或者3D的影响学资料证明了可以在48小时作用在肾脏中形成siRNA，并且累积在肾小管上皮细胞中，这个过程取决于壳聚糖的分子生物重量。壳聚糖或者siRNA纳米粒子通过知性嵌合的作用去除小鼠体内的megalin基因，广泛的分布在细胞中通过中介一个以已此基因为 依赖的内吞囊泡行为，在小鼠体内视同内吞壳聚糖或者AQP1行为在肾小管近段小管细胞中击倒水通道蛋白1的比例达到50%。总而言之，以PETCs为目标的壳聚糖纳米颗粒系统也许在PTECs中为一击溃特殊基因为目标提供了一个有用的策略，并且为治疗一系列肾脏疾病提供了一个有潜力的治疗方案。 简介： 慢性肾脏疾病影响10%-15%的普通人群并且发病率仍在上升。CKD经常作为糖尿病高血压以及炎症的并发症而发病。如果没有有效的治疗，CKD经常发展为肾纤维化，这种疾病是肾脏疾病的晚期病理类型。目前暂时没有针对ESRD有效的治疗措施，针对CKD新治疗方法的研究进展是以特殊基因靶向治疗为目的的治疗方案，目前被证明是有效的有潜力的临床治疗方案。RNA干扰为大量的适用性、高效性及特异性提供了一个基因沉默。因此，通过降低基因表达的活化RNAi为疾病的治疗提供了一个潜在有效的治疗方案。通过小干扰RNA介导进入细胞内部，提供了RNA诱导沉默丛(RISC)导链互补退化的mRNA有针对性。然而在试管中低的稳定性、低的生物渗透性和无效的组织细胞渗透性是小干扰RNA的关键问题。根据我们之前的经验,稳定和免疫原性问题可以通过引入化学修饰解决，例如定位或者非定位核酸，和循环时间和生物分布严重受寡核苷酸的转导到non-viral载体的影响。 小干扰rna的积累肾脏取决于小干扰rna是在肾小球中自由的滤过性。肾小球滤过率以及小干扰rna由肾小管上皮细胞吸收。使用水动力沉默方法，技术涉及快速尾静脉注入大大量的小干扰rna或缓冲区包含小发夹RNA表达DNA，它是可行的交付小干扰rna由于瞬态毛细管的管状上皮“漏”。然而,这种方法是伴随着肝损伤和局部肾脏障碍由于相关的高压管理，和不适用于到更大的动物模型和人类。局部管理小干扰rna直接优化选择肾已通过肾动脉和肾静脉形成。但这些技术的侵袭性也限制了对临床应用的使用。 对于小干扰RNA以及相关药物针对壳聚糖系统的应用取决于我们的实验室。我们之前的生物分布研究说明了使用特殊的壳聚糖形成小干扰RNA，造成了在肾脏中不同的小干扰RNA的堆积。在这里,我们显示实时体内氟再现生物图和免于组化进行分析小干扰rna纳米壳聚糖/纳米粒子在肾脏内存留至少48小时，尤其是在肾小管旁近端小管中。在对于摄取嵌合体小鼠条件敲除的小片断干扰rna-megalin基因研究中发现，PTECs摄取低分子重量壳聚糖是被清楚受体所介导，因为这种物质被当做水可溶性派生出的乙二醇。我们首次证明非水溶性壳聚糖复合物纳米粒子的多样性对于肾脏中PTEC的特殊性。而且，我们进一步探索了在PTECs中拆卸水通道蛋白1的这种技术，证明了这项原则即在PTEC中这个通道可以被当做一项新的战略对于特殊的基因靶向，因此，对于治疗肾脏疾病是一种潜在的治疗工具。 材料和方法： 小干扰RNA双倍准备 纳米颗粒规划 细胞系以及在试管中的转染 纳米可以注射在小鼠体内：1.壳聚糖的分子量的影响。2.荧光成像技术研究。3.细胞吸收的小干扰RNA壳聚糖/纳米粒子在Megalin小鼠中的条件。4.在小鼠身上AQP1基因沉默。 小分子RNA完整性评估，细胞定位和基因表达：1.siRNA通过Northern Blotting技术的完整性分析。2.RT-PCR的实时定量。3.荧光显微镜和免疫组化染色。4.统计分析。 结果： 1.在肾脏中使用化学修改的siRNA形成壳聚糖累积依赖于siRNA的修饰。 2.在肾脏中siRNA的累积取决于壳聚糖的分子量。 3.在肾脏PTECs中壳聚糖/siRNA的累积。 4.在PTECs中内吞囊泡摄取壳聚糖/siRNA以megalin基因为媒介。 5.在肾脏中chitosan/siRNA的累积动力学通过光学成像被观察到。 6.在小鼠肾脏中特异性阻断AQP1蛋白表达。 讨论： 在这份报告中,我们演示了具体的最终呈现了小干扰rna纳米颗粒/壳聚糖在肾脏PTECs的活动。我们已经使用了技术获取基因沉默PTECs AQP1的 ,因此,这“概念验证”不同的方法可以用于可拆卸其他基因在PTECs中。相比以前呈现的小干扰rna呈递方法,壳聚糖介导的PTEC