组织培养与植物转基因.ppt

植物基因工程是指把不同生物有机体的DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组DNA（Recombinant DNA）分子，然后转化到受体细胞（大肠杆菌）使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译或表达。 也称为植物遗传转化、植物转基因等。 2 植物基因工程的载体 T－DNA 4.2 微弹轰击法 原理：金属微粒在外力作用下达到一定速度后，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，仍能维持正常的生命活动。也称为基因枪法。 利用这一特性，先将含目的基因的外源DNA同钨、金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。 此方法可直接处理植物某器官或某组织，是当今普遍使用的植物转基因方法。 4.5 花粉管通道法 原理：将重组DNA涂于授粉的柱头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化尚不具有正常细胞壁的卵、合子和早期的胚胎细胞，在活体内产生转基因种子。 花粉管通道法 4.6 显微注射法 原理：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核中。 重要问题：必须把受体细胞进行固定。 动物细胞具有独特的贴壁生长待性，因此不存在固定细胞的问题。 植物细胞的显微注射必须建立固定细胞技术。目前有三种方法：①琼脂糖（低熔点）包埋法；②多聚-L-赖氨酸粘连法；②吸管（毛细管）支持法。 4.7 脂质体介导法 原理：脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA导人受体细胞。 包装成脂质体的DNA的转染串比裸露的DNA的转染率高出100倍。 如先用PEG处理培养的受体细胞，使其易吸收培养基中的脂质体，可提高转染率10—20倍。 在正常情况下，每个细胞平均可吸收1000个左右的脂质体。这是哺乳动物转基因研究中常用的方法之一。 4.8 激光微束穿孔法 原理：利用直径很小（纳米级）、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下用激光处理细胞，处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。 此方法最适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。 6 植物转基因产品的安全性国际大讨论 7 植物转基因的成果 植株再生是基因转移的关键步骤，直接决定能否获得转基因植株。 两种形式： 一种是愈伤组织再生 另一种是直接再生，从外植体直接诱导出芽而不经过愈伤组织的分化。 转墓因植株再生的方式与一般植株再生的方式相同，主要区别是转基因植株的再生受外源基因、载体系统、抗生素、转化过程的影响。 5 转基因植株的再生及其检测方法 5.1 转基因植株再生 常采用报告基因作为标记，以便快速检测。 主要采用分子生物学方法检测，包括：聚合酶链式反应(PCR)、Southern Blot、Northern Blot和Western Blot等方法。 进行分子生物学检测以后还要进行生物学鉴定，以确定基因是否可以正常地表达性状，并稳定地遗传给后代。 如果一些有价值的目的基因被转入，还必须鉴定基因的功能及其表型。 5.2 转基因植株的检测 如转化抗病毒基因：要对转基因植物进行病毒接种，以鉴定抗病毒能力。 若转化的基因为抗除草剂基因：还要对植物喷洒除草剂进行检测。 若转基因植物是食用粮食作物或油料：还要通过转基因植物的安全性检测，以免对人类和环境造成危害。 如果转化的是花色素合成酶基因：则凭肉眼就可直观鉴定花色变化。 斑蝶事件：1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44％的幼虫死亡。 现在这个事件也有了科学的结论： 第一，玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外５米，每一平方厘米马利筋叶片上只找到一个玉米花粉。 第二，2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用10倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。 加拿大“超级杂草”事件：由于基因漂流，在加拿大的油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”。 事实上，这种油菜在喷施另一种除草剂2，4-Ｄ后即被全部杀死。 应当指出的是，“超级杂草”并不是一个科学术语，而只是一个形象化的比喻，目前并没有证据证明已经有“超级杂草”的存在。 同时，基因漂流并不是从转基因作物开始，而是历来都有。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。 墨西哥玉米事件：2001年11月，美国