第十章免疫学诊断解析.ppt

* 免疫学诊断技术 抗原及抗体的制备 一、抗原的制备 1. 细菌抗原 细菌培养 灭活，加热或化学方法 离心洗涤 无活菌检验 配置成1亿菌量/mL的菌悬液 2. 细菌O抗原 细菌培养 100℃孵育2~2.5h，破坏H抗原 离心洗涤 无活菌检验 配置成约1亿菌量/mL的菌悬液即为O抗原 3. 细菌H抗原 细菌培养 0 .4%甲醛生理盐水洗刮菌苔 37℃水浴24h或4 ℃3~5d 无活菌检验 配置成约1亿菌量/mL的菌悬液即为H抗原 细菌培养 0 .5%甲醛溶液洗刮菌苔 离心洗涤，0.5%甲醛溶液4 ℃过夜 离心弃沉淀 上清10,000rpm冷冻离心15‘,弃 沉淀 上清40,000rpm冷冻离心2.5h，弃上清，沉淀悬浮于蒸馏水，即为H抗原 或 4. 细菌菌毛抗原 细菌培养 30%蔗糖溶液，剧烈震荡（620次/分 10,000rpm离心，15‘，弃沉淀 50,000rpm冷冻离心6h 沉淀用蒸馏水悬浮，即成菌毛抗原 5. 病毒抗原 沉淀用PBS悬浮 细胞培养物或组织悬液 反复冻融，3~4次 20,000rpm冷冻离心，弃沉淀 上清超速冷冻离心，或梯度离心 沉淀用PBS悬浮 收集病毒条带 6. 蛋白质抗原 离心分离（梯度离心），盐析（饱和硫酸铵）， 分子筛层析，离子交换层析 7. 半抗原 载体：HSA，BSA，OA，钥孔戚血蓝蛋白等 连接：多用化学方法。 炭化二亚胺法：缩合剂，既能缩合氨基又能缩合羧基 戊二醛法：以其两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接 氯甲酸异丁脂法：半抗原的羧基与载体蛋白的氨基以肽键相连 二、佐剂 1. 概念 凡能非特异性地通过物理或化学的方式与抗原结合而增强其特异免疫原性的物质。 2. 作用 储存作用 活化巨噬细胞，促进巨噬细胞与T、B的相互作用 增强机体对抗原的特异性免疫应答，提高抗体滴度 3. 常用佐剂 三、抗血清的制备 1. 抗体产生规律 2. 免疫动物选择 3. 免疫剂量 家兔 初次免疫：50~200ug，加福氏完全佐剂，背部皮下多点注射。 再次免疫： 50~200ug，加福氏不完全佐剂。 豚鼠和大鼠 初次免疫：10~100ug，加福氏完全佐剂，背部皮下多点注射。 再次免疫： 10~50ug，加福氏不完全佐剂。 小鼠 5~50ug 绵羊或山羊 初次免疫：0.5~10mg，加福氏完全佐剂，肌肉、皮下或皮内多点注射。 再次免疫： 0.5~10mg ，加福氏不完全佐剂。 鸡 初次免疫： 50~200ug，加福氏完全佐剂，胸肌多点注射。 再次免疫： 50~200ug，加福氏不完全佐剂。 4. 动物采血法 5. 血清分离 6. 免疫球蛋白的提取 四、单克隆抗体的制备 五、基因工程抗体的制备 图8-5 B细胞杂交瘤及单克隆抗体制备过程（据杜念兴） 凝聚性试验 抗原与相应抗体结合形成复合物，在电解质存在下，复合物相互凝形成肉眼可见的凝集小块或沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定抗体或抗原，称为凝聚性试验。 凝集试验 沉淀试验 颗粒性抗原与其相应的抗体发生特异性结合反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集团块的试验，称为凝集试验（agglutination）。 一、凝集试验 1. 直接凝集试验 玻片凝集，试管凝集 2. 间接凝集试验 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒表面（载体）然后再与相应的抗体（或抗原）作用，在适宜电解质条件下，发生特异性凝集反应，称为间接凝集试验。 间接血凝，乳胶凝集，碳凝集。 反向间接凝集试验 3. 协同凝集试验 覆盖有特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相应的抗原结合时，在适宜电解质条件下，发生特异性凝集反应，称为协同凝集试验。 富含SPA的金 IgG类 结合了IgG类抗体 抗 原 金黄色葡萄球菌 黄色葡萄球菌 抗 体 的金黄色葡萄球菌 的协同凝集 二、沉淀试验 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（precipitation test）。 环状沉淀试验，琼脂凝胶扩散试验，免疫电泳技术 标记抗体技术 根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术（labelled antibody technique）。 *