实验九碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶-副本汇编.ppt

碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶 原理 血清（或血浆）中α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较，从而推算出淀粉酶的活力单位。 试剂 操作步骤 计算 参考值 试 剂 1、0.4mg/ml底物缓冲液：4℃冰箱保存6个月。 2、0.1mol/L碘贮备液：4℃避光保存6个月。 0.01mol/L碘应用液的配制: 将碘贮备液:蒸馏水=1︰9稀释，现用现配4℃避光保存。 操作步骤 计 算 1、单位定义： 100ml血清（浆）中的AMS，在37℃与底物作用15分钟，水解5mg淀粉为1个单位。 2、公式： 样本最佳取样浓度摸索  根据不同动物血清及组织之间的差异，最好是在批量实验之前做个预试以确定最佳取样浓度。 例1：取大鼠血清用生理盐水稀释成不同浓度（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍），取样0.1ml进行检测 临床意义 淀粉酶可通过肾小球滤过。流行性胰腺炎，特别是急性胰腺炎时，血和尿中的AMY显著增高。急性胰腺炎发病后8~12h血清AMY开始升高，12~24h达高峰，2~5d下降至正常。如超过500U有意义，达350U时应怀疑有此病。 尿中AMY约于发病后12~24小时开始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值。 注意事项 酶活性在400U以下时，与底物的水解量成线性。如测定管吸光度小于空白管吸光度一半时，应加大血清稀释倍数或减少稀释血清加入量，测定结果再乘以稀释倍数。 草酸盐、拘橼酸盐、EDTA-Na2及氟化钠对AMY活性有抑制作用，肝素无抑制作用。 唾液含高浓度淀粉酶应防止带入。 淀粉产品不同，其空白吸光度可有明显差异，一般空白吸光度应在0.40以上。 注意事项 缓冲淀粉溶液若出现混浊或絮状物，表示缓冲淀粉溶液受污染或变质，不能再用，应重新配制。 本法适用于其他体液淀粉酶的测定。尿液先作20倍稀释后测定。 评价 本法线形范围400U，批内CV 3.1%~9.0%，批间CV 12.4%~15.1%，与对-硝基苯麦芽庚糖苷法相比较，在酶活性低时相关性好，但酶活性较高时相关性差，因此，该法不能认为是淀粉酶测定的理想方法。但由于该法简单、易行，不需特殊设备、试剂低廉，仍然是我国目前应用较为广泛的方法。 * * 混匀，660nm波长，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。 *注：不同样本批量测试前需要做预实验，确定最佳取样浓度，将 (空白OD-测定OD)控制在0.05~0.150之间 *