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实验二 蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同的进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开来一样。但是这种“过筛”与普通过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸，使充分洗液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而言凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，而使样品分子不同的分子得到分离。 凝胶室又叫退溶液凝结而成的固体物质，不论是天然还是人工合成凝胶，他们的内部都具有很多和微细的多孔网状机构，凝胶层析法常用天然凝胶是琼脂凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶，和葡萄糖凝胶，具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，起孔隙代销与被分离物质分子的大小有相似的数量级，在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只能有相应的小分子可以通过，适用于分离小物质。相反，交联度低的孔隙大，适用于分离大分子的物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装在柱子里，柱床体积称为总体积，以Vt表示。实质上Vt是由Vo、Vi与Vg三部分组成，既Vt Vi+Vg+Vo。Vo称为孔隙体积或者外体积，又称为外水体积，即存在于柱床内凝胶克里外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内部流动相的体积；Vi为内部体积，济宁叫颗粒内部所含水相的体积，因此Vt-Vo Vi+Vg 脱洗体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve Vo+KdVi 式子中的Ve为脱水体积，自加入样品时算起，到祖坟最大浓度出现时候流出的体积，Kd为样品组分在二相间的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，与柱的长短粗细无关，也就是说他对每一个物质为常数。与柱的物理条件无关。Kd可以通过实验室求得。上式子可改写成： Kd （Ve-Vo /Vi，Vo表示外体积；Vi内体积；VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况： 1、当Kd 0时，则Ve Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积 2、当Kd 1时，Ve Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和 。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。 3、当0 Kd 1时，Ve Vo+KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Vo即在Vo与Vo+Vi之间变化。 4、有时Kd 1时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve Vo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd 1。如苯丙氨酸，络氨酸和色氨Sephadx G-25中德Kd值分别为1.2，1.4和2.2。 在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd 1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g·WR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav（有效分配系数）代替Kd，其定义如下： 已知 Kd Ve-VoVi， Vt-Vo代替Vi，则：Kav Ve-Vo/Vt-Vo 即 Va Vo+Kav Vt-Vo 在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水Vt-Vo作为固定相，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流动Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，只一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。 Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱是，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示： Ve K1-K2logM K1与K2为常数，M为分子数，Ve也可用Ve-Vo（分离体积）,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt（简化的洗脱体积,它受柱的填充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作