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土壤DNA提取研究进展 　　摘要：DNA提取是分子生物学研究的基础，提取的DNA具备足够的纯度和结构完整性是进行PCR扩增等分子分析所必需的条件。土壤的组成和结构复杂，且类型多样，影响土壤DNA提取的因素有很多，研究土壤微生物多样性，关键是提取出足够数量、纯度、适当片段长度、具有代表性的土壤DNA。本文对土壤DNA提取的相关方面作了些论述，并探讨了DNA提取对土壤微生物多样性评估的偏差影响，最后进行了讨论和展望。 　　关键词： DNA提取 土壤 微生物多样性 　　土壤是微生物生活的主要场所，蕴含着丰富的微生物资源并表现出高度的多样性，据估计每克土壤中含有4000-7000种近109个细菌细胞，含有几千到上百万种不同的基因组信息。长期以来，对土壤微生物的研究仅限于极少部分可培养的微生物，而这种可培养的微生物还不到自然界微生物总量的1%，实际上绝大多数环境微生物都是不可或很难被培养的，利用传统的培养方法研究土壤微生物多样性，具有很强的偏好性。随着发展起来的宏基因组学利用分子生物学的研究方法绕过培养方法来研究微生物多样性及功能这一局限，为土壤微生物研究开辟了新的道路[1]。而宏基因组学技术在研究土壤微生物方面的关键第一步是提取DNA。 　　提取高浓度、大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA对土壤微生物多样性研究至关重要。然而，土壤是一个非常复杂的异质体系，其中含有的腐植酸及腐植酸类似物、酚类化合物、重金属离子等，在DNA提取过程中如不能有效去除，将直接影响后续的PCR扩增、核酸杂交、内切酶消化等分子操作[2]。土壤微生物DNA的提取纯化是一个耗时、繁琐的过程，许多学者一直在探索更加快速、高效、低成本的土壤DNA提取方法。下面就近年来已发表的国内外DNA提取相关方面的文献，对DNA提取作了些论述。 　　一、土壤DNA 　　土壤中的DNA主要存在于细胞核内，核内DNA占整个细胞DNA量的90%以上，核外DNA主要有线粒体DNA和质粒DNA，因此，土壤DNA提取主要获得的是核内DNA[3]。 　　二、影响土壤DNA提取的主要因素 　　影响土壤DNA提取的因素主要有以下几点：1）DNA与土壤环境基质的相互作用。DNA与粘土矿物、高含量有机质等之间的吸附会降低DNA提取产量。2）DNA共提取物。土壤中含有的腐植酸及腐植酸类似物、酚类化合物、重金属离子等对土壤DNA提取存在影响，限制性内切酶活性在共提取的腐植酸浓度为0.8-51.71μg/mL时就受到抑制，且Taq聚合酶对腐植酸具有高抑制敏感性[4]。3）DNA的降解、损失或损伤。土壤样品保存方法不当，会导致微生物细胞降解或DNA降解，如土壤样品储存在4℃下3周，高分子量DNA显著减少[5]；还有DNA提取过程越繁琐或步骤越多，DNA损失就越多，DNA提取过程中的剪切力也会对DNA分子会造成损伤。4）细胞不完全裂解。 　　三、土壤DNA提取方法 　　土壤样品的DNA提取，通常包括细胞裂解、细胞碎片的去除和核酸的沉淀与纯化三个步骤。根据微生物细胞是否需要从他们的环境基质中分离出来，可将DNA提取方法分为直接法和间接法，直接法耗时短且具有更好的DNA恢复率，可以获得更好体现样品微生物多样性的代表性DNA，从而直接法得到更为普遍的应用[6]。 　　已经出现了很多被接纳并广泛使用的土壤DNA提取方法，可以说这些方法被当作了标准。其中，Zhou 等[7]于1996年提出了一种多元组成土壤DNA恢复方法，该研究为应对某一具体的土样提供了指导便于选择适当的DNA提取和纯化方法。有人在此基础上，改进了方案，来提取几种性质不同的土壤样品DNA，并得到了较好的结果[8]。而有些土壤样品来自于极端环境或由于本身特性，提取出满足用于分子分析的DNA比较困难。这时结合使用不同的细胞裂解方法就显得特别重要（常见的细胞裂解方法见表1）。例如引进土壤预洗涤程序用于提取一般有机质（腐植酸）和金属离子含量比较高的森林土样DNA，DNA提取产量和质量可以得到改善[9]。风沙土壤本身微生物数量较低，需要采取特殊的土壤处理方法，以获得足够产量的DNA，张颖等人也报道了一种风沙土壤微生物总DNA提取方法，获得的DNA可直接用于PCR分析[10]。还有，一些极端环境如火山土壤样品DNA提取面临着粘土和其他矿物含量高的难题，Ruth M.Henneberger等[11]尝试了各种提取方法，最终成功地提取到了效果较好的DNA，这都证明了结合使用不同提取处理的重要性。 　　DNA提取技术除了在土壤样品上的应用外，还有很多其他的环境样品如沉积物、堆肥、植物组织、动物标本、消化物或粪便、骨骼牙齿、化石冰与冻土、碳酸盐岩石、唾液等。另一方面，DNA提取技术的不断发展与成熟也促进了市场上出现了许多各种各样的