生物化学56552.ppt

（二）糖类药物的设计与应用 1.确定有效的糖类药物； 2.合成糖链 3.设计衍生物对糖类药物的作用及性质进行改善； 4.设计糖类药物的模拟物 （三）糖类药物的模拟 寻找糖类模拟物的目的 糖类分子中有多个可反应的羟基 糖链生物合成/化学合成比较困难 寻找糖类替代分子很重要 二、糖基化工程 （一）糖基化及其对重组蛋白质性质的影响 糖基化的概念： 多肽主链上共价附加糖基，是真核细胞蛋白质翻译后加工的过程。 糖基化对重组蛋白质的影响： 溶解度； 热力学稳定性； 抗蛋白酶水解稳定性； 生物活性； 四级结构； 特异识别； 靶向性； 抗原性； 半衰期； 。。。。。 （二）糖基化工程的概念 什么是糖基化工程？ 糖基化工程是通过人为操作（增加/删除/调整）蛋白质上的寡糖链，产生适合的糖形，从而改变糖蛋白的生物学功能。 糖形（glycoform） 相同的多肽链上共价相连着不同的聚糖结构 不同糖形有不同理化特征，导致糖蛋白的功能多样性。 增加合成或分泌的效率； 增加溶解性； 延长生物学半衰期； 增强生物学活性； 增强稳定性和蛋白酶抗性； 降低异质性； 靶向进入或离开特定组织； 有利于纯化和质量控制； 有助于结晶 Stanley“糖基化工程”综述糖基化工程优点： （三）糖基化工程的研究方法 选择特异的宿主细胞； 细菌 酵母 昆虫 哺乳动物细胞 应用哺乳动物糖基化突变型； 改变培养基的组成； 利用突变删除/增加糖基化位点； 利用糖基化抑制糖苷酶/糖基转移酶处理纯化糖蛋白。 （四）糖组学 糖组和糖组学的概念 糖组：单一个体的全部聚糖； 糖组学：对糖组的全部聚糖结构进行分析，确定编码聚糖的基因（糖基转移酶）和蛋白质糖基化的机制。 糖组学主要解决的问题 基因信息（主要是糖基转移酶）； - 什么基因编码糖蛋白的聚糖链 糖基化位点信息； -可能糖基化位点中实际被糖基化的位点； 结构信息； -聚糖结构 功能信息 -糖基化功能 （三）多糖的降解 天然多糖： 分子量较大； 具有紧密的晶体结构； 不溶于普通溶剂； 应用范围受限； 降解成低聚糖衍生物可以扩大使用范围。 多糖的降解方法： 化学降解法； 酶法降解； 辐射降解； 。。。 1.化学降解法 肝素的化学降解法：亚硝酸控制降解法 亚硝酸浓度0.01-1.0%； 反应温度-30至-5； pH1.5； 5至10分钟； N-硫酸葡萄糖胺单位——脱去HSO4-形成-NH2 ——与HNO2发生重氮化反应——放氮、糖苷键断裂、电子转移——缩环生成2,5-脱氢甘露糖或脱氢甘露糖醇——得到平均分子量6kD的片段分子 2.酶法降解 肝素酶 特异性断裂肝素链上具有特殊修饰的不同序列——产生不同的寡糖片段 肝素酶法降解可用来分析肝素的结构和制备低分子量肝素 3.辐射降解法 化学降解壳聚糖：三废严重， 不利环保； 酶法降解壳聚糖：产量低，成本高。 辐射法：60Co照射甲壳素，分子产生电离或激发等物理效应——化学变化，分子间形成化学键-辐射交联——导致分子链断裂-辐射降解。 优点： 无须添加物的固相反应 易控制 无污染 品质高。 五、多糖的理化性质测定 （一）多糖的含量测定 总糖含量测定： 硫酸-蒽酮法：快速、简便； 蒽酮和多糖中己糖基、戊醛糖和己糖醛酸反应； 蒽酮试剂：2g蒽酮溶于1L 80%硫酸中； 试液1ml+4ml蒽酮试剂，沸水浴煮沸10min后溶液呈蓝绿色，620nm处最大吸收。 （二）多糖的纯度分析 多糖纯度的判断： 糖基的摩尔比是否恒定； 电泳是否呈现一条带； 柱层析是否呈单一峰。 1. 电泳法: 醋酸纤维素膜电泳； 玻璃纤维纸电泳； 聚丙烯酰胺凝胶电泳； 琼脂糖电泳； 。。。。 中性多糖导电性弱； 高电压电泳； pH9-12硼酸盐缓冲液。 显色剂： 阿利新蓝、甲苯胺蓝、p-茴香胺硫酸试剂、高碘酸-希夫试剂 多糖纯度测定的方法： 2.凝胶柱层析法 Sephadex G-150; Sephadex G-200; DEAE-纤维素； 。。。 判断纯度的标准： 柱层析呈现一个峰。 3.紫外扫描法 多糖紫外特征吸收在200nm； 核酸紫外吸收260nm； 蛋白紫外吸收280nm； 检查多糖中是否有核酸或蛋白质类物质。 4.其他方法： 官能团分析 纸层析 水解后糖组分分析 （三）多糖的分子量测定 1.凝胶柱层析法 Sephadex/Sepharose柱； 需结构相似、分子量已知的多糖做标准曲线； 洗脱液可显色鉴定多糖； 2.特性黏度法 η=KM2 利用已知的多糖确定K值，测定粘度值，计算得到分子量； 五、多糖的结构分析 物理方法： 红外光谱； 磁共振光谱； 质谱； X线衍射； 。。。 化学方法： 化学降解法； 酶降解法； 免疫化学法； 放