基于蛋白质组学的细胞色素P450和葡萄糖醛酸转移酶亚型绝对定量分析.docVIP

基于蛋白质组学的细胞色素P450和葡萄糖醛酸转移酶亚型绝对定量分析 摘要：利用蛋白质组学方法，将大鼠肝微粒体样品进行胰蛋白酶水解；再利用液相色谱串联质谱法（LCMS/MS），采用多反应监测模式（MRM），通过测定蛋白质水解后产生的特征酶切肽段，实现同时对大鼠肝微粒体内药物代谢酶P450和UGT的绝对定量。本实验首先建立标准工作曲线，对肝微粒体样品中P450和UGT进行定量，在线性范围内，相关系数r 0.995，线性关系良好，定量限≤10 nmol/L；以合成的稳定同位素标记特征肽段作为内标，对UGT1A1进行定量分析。结果表明，同位素标记特征肽段与未标记肽段色谱行为与质谱响应一致，在基质溶液中同位素标记肽段线性关系良好，利用标准曲线法和稳定同位素稀释法测得UGT1A1含量分别为17.30和18.23 nmol/g，两种方法所得结果基本一致，但稳定同位素稀释法操作简便，更适用于复杂样品的高通量测定。 关键词：葡萄糖醛酸转移酶； 多反应监测； 肝微粒体； 细胞色素P450； 气相色谱串联质谱 1引言 药物进入体内，可以通过代谢以一种或多种有活性的或无活性的代谢产物形式进行清除。当药物主要以代谢方式清除时，代谢途径对药物的安全性和疗效有很大的影响[1，2]。在参与药物代谢的各类酶中，细胞色素P450酶（简称CYP或P450）和尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶（UGT）介导绝大部分的代谢反应。因此，实现对P450和UGT家族中多种酶的定量，对研究药物代谢具有重要意义，从而为药物研发、药物药物相互作用（DDI）及临床前药代动力学研究提供科学依据。在过去的研究中，常通过逆转录聚合酶链式反应法（RTPCR）[3，4]、2维电泳法（2DPAGE）[5]＼，免疫印迹法（Western blotting）[6，7]及探针底物法[8，9]对药物代谢酶进行评价。由于mRNA的翻译过程受多种因素的影响，因此测得的mRNA的量不能准确代表蛋白酶的水平； 又因为药物代谢酶具有高度的序列同源性，使得现有方法专属性差，伴有一定的交叉反应，这些方法上的缺点都限制了对药物代谢酶的研究。 随着质谱技术的发展和在蛋白质组学研究中的应用，实现了对复杂体系中蛋白肽类物质的定性和定量研究[10～14] ，也为药物代谢酶的定量提供了理论依据和实验基础。本实验通过分析药物代谢酶的氨基酸序列，找出能代表各蛋白酶的特征肽段，利用高效液相色谱串联质谱技术以及标准曲线法，同时实现对P450和UGT的直接定量分析；以合成的同位素标记肽段作为内标，对复杂基质中待测物进行定量。以往的间接定量实验操作繁琐，影响因素多，所得结果不能直观反应实际药物代谢酶水平。本实验具有准确性高，重现性好，定量限低，高通量等优点，可用于药物代谢酶的相关研究。 2实验部分 2.1仪器与试剂 3结果与讨论 3.1目标肽段的选择及色谱、质谱条件的确定 通过对待测P450和UGT各酶亚型氨基酸序列进行分析和检索，选择理论上可代表各酶亚型的多个特征肽段； 采用高分辨质谱LTQOrbitrap对肝微粒体酶解样品进行测定[15]。根据样品实际谱图并参照特征肽段选择基本原则[16]，确定能够代表各酶亚型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR为例，首先通过高分辨质谱对肝微粒体样品进行一级扫描 （图1A）；然后对[M+2H]2+母离子（m/z 668.85）进行二级扫描和数据库检索[15]（图1B），从而确定了肽段SVFDQDPFLL为UGT1A1的特征序列。 由于不同类型仪器产生的碎片离子丰度不同[17]，为更好地利用多反应监测（MRM）模式对各酶亚型的特征肽段进行定量分析，需合成相应特征肽段的标准品进行质谱条件的优化。首先通过串联质谱母离子扫描确定响应值较高的母离子，如图1C，确定用于定量分析的母离子m/z 669.1；选择合适的能量，将母离子打碎；选择响应值较高且稳定的碎片离子，如图1D，确定用于定量分析的子离子为m/z 645.5； 通过MRM实现对特征肽段的定量分析。 且可有效消除由基质效应所带来的误差。如图3所示，在甲酸溶液（0.1%）中，相同浓度的稳定同位素标记特征肽段与非标记特征肽段色谱保留行为一致，稳定同位素标记特征肽段与非标记特征肽段峰面积比值为1∶1.03， 响应值基本相同，因此可以利用稳定同位素标记特征肽段作为内标进行定量分析。由图4可见，稳定同位素标记特征肽段在含有基质的M溶液中线性良好，能作为内标进行定量分析。 3.4大鼠肝微粒体样品的测定