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宰后牦牛肉成熟过程中钙激活酶与嫩度指标的相关性分析 　　摘 要：以10头甘南牦牛为研究对象，对宰后8d 成熟期间肌原纤维小片化指数、剪切力、肌纤维直径、μ-钙蛋白酶（μ-calpain）、m-钙蛋白酶（m-calpain）、钙蛋白酶抑素（calpastatin）的活力进行了测定，同时研究了3种酶活力与肌原纤维小片化指数、剪切力、肌纤维直径3个嫩度指标之间的相关性。结果表明：μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3种酶与剪切力值及肌纤维直径均呈正相关；3种酶与肌原纤维小片化指数呈负相关，其中μ-calpain与calpastatin呈显著负相关（P0.05）。因此，钙激活酶活力的变化可能导致了肌原纤维小片化指数的增加，肌原纤维的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要贡献者。 　　关键词：牦牛肉；成熟；钙激活酶；嫩度 　　中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）06-0001-04 　　肉的嫩度是所有肉品质中最重要的指标之一，它将决定肉是否被重复购买[1-2]。成熟是改善肉嫩度的有效方法之一。肉的最终嫩度取决于由内源蛋白酶引起的肌原纤维结构改变和弱化的程度，这些内源蛋白酶包括钙激活酶、组织蛋白酶、细胞凋亡酶、蛋白酶体等[3]。目前，普遍认为，钙激活酶在肉的嫩化中起着重要的作用[4]。骨骼肌中的钙蛋白酶包括钙蛋白酶1（μ-calpain）、钙蛋白酶2（m-calpain）、钙蛋白酶3（p94）以及钙激活酶的内源性的专一抑制蛋白（calpastatin）[5]。 　　李诚等[6]研究表明，杜长大三元杂交猪的背最长肌（longissimus dorsi，LDM）、腰大肌（psoas major，PM）两种不同部位猪肉在宰后0～4℃冷却成熟过程中钙蛋白酶粗酶液活性、肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）和剪切力之间呈现较高的相关性。田甲春等[7]研究发现，青海牦牛肉成熟过程中MFI 和钙激活酶活性相关性极显著，与组织蛋白酶L活性相关性显著，钙激活酶活性与组织蛋白酶L活性呈显著负相关。郭兆斌等[8]研究了甘南牦牛肉成熟过程中食用品质、钙激活酶粗酶活性、肌原纤维超微结构的变化规律。关于宰后牦牛肉成熟过程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的变化报道极少，特别是甘南牦牛肉成熟过程中μ-calpain，m-calpain及calpastatin的变化及其与嫩度指标的相关性未见报道。本实验旨在研究甘南牦牛肉宰后成熟过程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的变化及其与嫩度指标的相关性，以便为构建牦牛肉嫩度的预测模型提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料及试剂 　　随机选取甘南藏族自治州夏河县，自然放牧条件下，发育正常健康无病、年龄3岁左右的黑牦牛12头，进行屠宰，宰后牦牛的背最长肌立即被移除，分割成平均质量为50g的样品，带回实验室，在0～4℃的条件下成熟0、1、3、5、7、8d，不同成熟时间点收集的样品，一部分在-80℃的条件下冷冻用于测定钙激活酶的活性，另一部分测定剪切力、肌原纤维小片化指数及肌纤维直径。酪蛋白、Tris、MCE、亮肽素、PMSF、卵类黏蛋白抑制剂、EDTA均购自Sigma公司。 　　1.2 仪器与设备 　　C-LM型数显式肌肉嫩度仪 北京阳光亿事达贸易有限公司；PPS-2蛋白纯化系统 上海金达生化仪器公司；XSP-8CA显微镜 上海光学仪器一厂。 　　1.3 方法 　　1.3.1 肌原纤维小片化指数测定 　　参考Kriese等[9]的方法进行测定。 　　1.3.2 剪切力测定 　　沿着肌纤维方向取厚度3cm的肉样，在80℃水浴锅中恒温加热至肉样中心温度达75℃，取出冷却至室温后，用直径1.27cm的取样器沿肌纤维方向钻取3个肉柱测定样，用嫩度仪测定剪切力值，剪切力值以N表示。每个肉样平行测定3次，取平均值。 　　1.3.3 肌纤维直径测定 　　参考李鹏等[10]的方法，取背最长肌的中央部位 3cm×2cm×1cm肉块3块，浸泡到1：10（V/V）甲醛溶液中，然后在10×40倍显微镜下随机计数200根肌纤维直径，求其平均值。 　　1.3.4 钙激活酶活性的测定 　　1.3.4.1 酶的分离与纯化 　　参考Delgado等[11]的方法并稍做改动。取宰后不同时间点的牦牛肉样品，准确记录其质量，绞碎后于4℃匀浆，加入150mL抽提液（pH8.3、100mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，10mmol/L β-巯基乙醇（MCE），100mg/L 卵类黏蛋白抑制剂，2