掌叶半夏（虎掌南星）矾制前后致炎毒性比较研究.docVIP

掌叶半夏（虎掌南星）矾制前后致炎毒性比较研究 [摘要] 目的：探索掌叶半夏致炎毒性及白矾炮制对其致炎作用的影响。方法：自掌叶半夏鲜品中分离毒针晶及掌叶半夏凝集素蛋白；采用整体动物及细胞水平模型，以炎症介质为指标，考察掌叶半夏毒性成分毒针晶和凝集素蛋白的致炎效应，及矾制对致炎作用的影响。结果：腹腔注射掌叶半夏毒针晶混悬液可使小鼠腹腔渗出液中炎症介质PGE2，NO含量显著增加，矾制后生品及毒针晶诱导的PGE2，NO释放显著下降；掌叶半夏凝集素蛋白刺激小鼠巨噬细胞后，在一定时间内可导致剂量依赖性的炎症因子TNF-α及IL-6含量显著增加。矾制后凝集素蛋白诱导的小鼠腹腔渗出液中PGE2含量显著下降。结论：掌叶半夏的刺激性毒性在机体表现为炎症反应，其所含的毒针晶及凝集素蛋白是其毒性成分，均可导致显著的炎症介质释放。矾制可显著降低掌叶半夏毒性成分的致炎毒性。 [关键词] 掌叶半夏；毒针晶；凝集素蛋白；致炎作用；白矾炮制 [收稿日期] 2013-03-23 [基金项目] 国家自然科学基金项目（座机电话号码，座机电话号码）；教育部博士点教师基金项目（座机电话号码120010）；南京中医药大学中药学江苏省优势学科开放课题项目（2011ZYX2-012） [通信作者] 吴皓，博士生导师，Tel：（025）座机电话号码，E-mail：whao5795@ [作者简介] 郁红礼，助理研究员，研究方向为中药炮制学，Tel：（025）座机电话号码，E-mail：yuhongli76@126.com 掌叶半夏，又名虎掌南星或简称为虎掌，为天南星科植物掌叶半夏的Pinellia pedatiecta Schott.的干燥块茎，辛、温，有毒，始载于《神农本草经》[1]，具有燥湿化痰、祛风定惊、消肿散结之功效，市场上多作为天南星的代用品广泛流通。文献显示，天南星科有毒中药以掌叶半夏的毒性最强，其毒性主要表现对口腔、咽喉等的强烈刺激[2]，临床大多使用炮制品。课题组前期研究表明，掌叶半夏的毒性成分为毒针晶，块茎中含大量细长、质地柔韧、两端尖而锋利的针状样晶体，可刺入机体组织引起刺激疼痛感[2-4]。毒针晶可引起家兔眼结膜强烈水肿[2]。毒针晶主要由草酸钙、蛋白组成[5]。在掌叶半夏毒针晶蛋白中可检测到掌叶半夏凝集素蛋白（P.pedatiecta agglutinin，PPA）[6]，PPA可诱导大鼠中性粒细胞的迁移作用[7]，研究显示掌叶半夏的刺激性毒性可能与诱发炎症相关。为进一步研究掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白诱发炎症毒性的作用及白矾炮制对致炎毒性的影响，本实验采用整体及细胞模型，以炎症介质为指标，研究掌叶半夏毒性成分毒针晶及凝集素蛋白矾制前后致炎毒性的变化，为天南星有毒中药的炮制机制的阐释、炮制方法的改进创新及临床安全应用提供理论依据。 1 材料 AKTA Purifier蛋白液相色谱纯化系统（Amersham Biosciences，美国GE公司）；冷冻干燥机（美国Labconco公司）；SP-754PC型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；SPECTRA MAX 190酶标仪（美国AD公司）；苯基琼脂糖凝胶柱HiPrepTM Phenyl FF（High sub）（16/10，20 mL，美国GE公司）；强阴离子型离子交换柱HitrapTM Q FF（5 mL，美国GE公司）；凝胶过滤色谱柱HitrapTM Desalting（5 mL，美国GE公司）；透析袋（截油相对分子质量7 000，BIOSHARP）。 凯基Braford蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号座机电话号码）；一氧化氮测试盒（南京建成生物工程研究所，批号座机电话号码）；Mouse IL-6 ELISA 试剂盒 （eBioscience，批号E09358-1634）；Mouse TNF-α ELISA试剂盒（eBioscience，批号E09479-1638）；生理盐水（南京小营药业集团，批号座机电话号码02）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号T座机电话号码）；其他试剂均为分析纯；所有溶液均用去离子水配制。掌叶半夏鲜品购自河北安国中药材种植基地，经南京中医药大学王春根教授鉴定为天南星科植物掌叶半夏P.pedatiecta 的块茎。 ICR小鼠，雄性，体重18～20 g，由上海斯莱克动物有限责任公司提供，合格证号[SCXK（沪）2007-0005]。 2 方法 2.1 样品制备 掌叶半夏毒针晶的提取分离[6]：掌叶半夏鲜品去皮后搅碎，加入有机溶剂少量多次研磨提取，合并混悬液，低速分级离心（500～1 500 r?min-1），过滤，分离得针晶。 掌叶半夏凝集素蛋白的分离纯化[8]：将掌叶半夏鲜品块茎50 g洗净，去皮，加去离子水100 mL，匀浆捣碎，离心