GST-pullown分离CA-CaRop1和DN-CaRop1的互作蛋白,及亲和差异性的分析.docVIP

实验设计：GST-Pulldown分离CA-CaRop1和DN-CaRop1的互作蛋白，及亲和差异性的分析 一、重组诱饵蛋白的获得（DN-GST, CA-GST）μl菌液到20ml LB培养基中摇荡培养约为1h，至OD值约为0.5~1.0为佳，同时扩上5瓶，保证足够的融合蛋白以备后续实验。 诱导，加入200μl的IPTG,至终浓度为1mM，28℃摇荡诱导培养7h。 取出1ml诱导菌液以及未诱导菌液进行SDS表达验证。 剩余菌液5000*g离心5min，去除培养基，加入5ml裂解缓冲液，混匀后5000*g离心5min,收集菌体，-80℃保存备用。 缓冲液的配制以及细胞的破碎 裂解缓冲液配方：50mmol/L Tris-Hcl pH 7.5, 150mmol/L NaCl, 1mmol/L EDTA 用时加入 0.3mmol/L DTT, 0.1% NP-40 蛋白酶抑制剂。 细胞裂解之前最好先加入裂解缓冲液（1:10，v/v）mM Tris-Cl pH 7.6 50mM NaCl 5mM MgCl 5mM EDTA 1mM DTT NP-40 0.5% Triton X-100 植物蛋白酶抑制剂 植物总蛋白的提取方法：从-80℃中取出辣椒叶片（青枯病处理与未处