抗细菌转基因工程课程要点要点.pptVIP

主讲人：李立志 第三小组成员:李立志、李小强、李瑜 水稻细条病的发现 水稻细菌性条斑病 简称细条病 由 Xanthomonascam Pestris pv. Oryzicola（简称Xoc）引起。 最早在1918年由Reinking首次报道了菲律宾水稻上发生细条病,在我国范怀忠等 1957 于20世纪50年代在广东省首先发现该病害。开始时误认为是白叶姑病，后经方中达等 1957 将该病与白叶枯病区分开来’确认为一种新的由细菌性病害。 病菌特点 该病菌属黄单胞杆菌属细菌,生长最适温28-30°C。低于16°C基本不发病。细条病的发生初侵染源主要有稻种、稻草和自生稻带菌,但也不排除野生稻、李氏禾的交叉传染。 病原菌主要从伤口侵入,菌脓可借风、雨、露等传播后进行再侵染。高温高湿等有利于病害发生。台风暴雨造成伤口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水过深加重发病。 水稻细条病的发病特点 危害水稻的主要特点: 主要侵害水稻叶片,病斑初呈暗绿色水橫状半透明小斑点,后逐渐沿叶脉方向扩展,成黄褐色,干结后呈黄色树胶状小粒,形如虚线,不易脱落。发病严iR吋,条斑融合成不规则的黄褐色至枯白色大斑块,外观与白叶枯病有些相似,但对光观察,病斑呈半透明状。病害流行时,叶片卷曲,完全呈一片白色。该病在水稻生长前期、后期都易感染,苗期症状较白叶枯病明显;病害严重时能引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使能够抽穗结实,但批谷增多,千粒重降低。一般年份可减产10%-20%,在气候条件沾发病严重时达40%。 Rxo1 基因来源 Rxo1 基因是来自玉米的一个抗玉米细菌性条斑病的寄主抗性基因，将其转入水稻后转基因水稻中接种细菌性条斑病病原菌，在接种点处表现典型的 HR 表型，证实该基因为一重要的非寄主抗性基因。 Rxo1 基因定位 Rxo1 基因CDS 序列全长（从起始密码子 ATG 到终止密码子 TAG）为 2718bp。与许多 R 基因一样，该基因编码的产物是 NBS-LRR 结构的抗病蛋白（GenBank登录号为 AAX31149.1），其蛋白质序列为 905aa。根据 SMART 数据库软件扫描该蛋白的 domains、repeats、motifs，找到一个从 4-18 位点的 low compositional complexity：IAVLLVLKKIAIALA 及一个位于 118-147 的 coiled coil region（LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK）；此外还预测到了 37 个其余结构（如 UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADH-G_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、LRR_CC、LRR_TYP 及 LRR_SD22 等），但是其显著性未达到极显著的阈值。Sanger 的分析则找到 3 个 Pfam-A matchs，其中显著的一个是 NB-ARC 结构：envelope 范围是 183-470；比对结果的范围则是 185-467；HMM 范围为3-282；另有两个非显著的 4 个 copy 的 LRR 结构。 基因Rxo1 的双右边界双元载体的构建 1. 1 菌株和载体 含有9kb Rxo1 基因的pCAMBIA1305-1 Rxo1 质粒由美国堪萨斯州立大学Scot H. Hulbert 博士提供。pCAMBIA1305-1 质粒是由澳大利亚CAMBIA 研究中心构建的含有35S 启动子和细菌卡那霉素抗性基因的双元载体。采用的农杆菌菌株为EHA105。 （1）美国Kansas州立大学的Scot H. Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1质粒，其中 携带有外源目的基因Rxol; pCAMBIA1305-1质粒 （2）澳大利亚CSIRO Plant Industry的M Upadhyaha博士提供双右边界双元载体pMNDRBBin6。该载体用于转接Rxol基因并将重组体转化到农杆菌中进行后续转基因: 双右边界双元载体pMNDRBBin6结构图及可能产生的3种T DNA类型 3 农杆菌菌株为LBA4404; 4 大肠杆菌菌株为DHSa ; 1.2双右边界双元载体的构建 1.感受态细胞的制备和转化 2. 双右边界双元载体构建 （1）目的基因和载体的酶切连接 将携带Rxol基因的载体pCAMBIA1305-1用限制性内切酶Sac I AGTVACT , NgoMN GV CCGGC 进行消化，同时，用限制性内切酶Xma I C V CCGGG 和Hpa I GTT V AAC 消化载体pMNDRBBin6。将酶切后得到的目的基因片断和双元载体用T4噬菌体连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌。 质粒pCAMBIA13