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弓形虫病诊断技术概述 　　摘要：弓形虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患病。因此建立快速、准确、特异的弓形虫病诊断方法尤为重要，对该病在病原学、免疫学及分子生物学方面的诊断方法进行了简要概述。 　　关键词：弓形虫病；病原学诊断；免疫学诊断；分子生物学诊断 　　中图分类号： S852.72+9 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）12-0019-02 　　弓形虫是一种专性细胞寄生原虫，具有广泛的宿主群并在世界范围内流行，能引起人兽共患寄生虫病。在畜牧业方面，弓形虫会使怀孕母畜流产，猪感染弓形虫会引起大批死亡。弓形虫病不仅对畜禽危害严重，还是影响人类优生优育的一个重要生物因子。怀孕妇女感染弓形虫，无论有无临床症状，有一半左右可以发生母胎垂直感染，出现流产、死胎以及致使胎婴先天性缺陷或畸形等。近年来，我国学者在弓形虫病的流行情况、致病作用、诊断方法以及防制等方面都进行了研究，现对该病的诊断技术进行概述。 　　1 病原学诊断 　　1.1 组织学诊断 　　组织切片或体液涂片（如脑脊液、羊水或支气管灌洗液） 查找弓形虫速殖子可以诊断弓形虫的急性感染。但在传统染色的组织切片中查找速殖子较为困难，弓形虫抗血清的过氧化物免疫酶标记法被证明具有良好的敏感性和特异性，能够成功检测到AIDS患者中枢神经系统（CNS）中弓形虫的存在。免疫过氧化物酶法也适用于未固定或用福尔马林固定的石蜡组织切片。此外，还可通过对脑脊液的离心沉淀或组织进行瑞氏-姬姆萨染色涂片。对炎症灶邻近的组织囊肿用上述方法检查可进行急性感染和潜伏感染的诊断。 　　1.2 动物实验和细胞培养 　　动物接种是一种最为经典、能直接确认病原体存在的方法。孙新[1]用小鼠腹腔接种和THP21 细胞培养的方法对30例孕妇羊水进行病原分离比较， 两组共分离出6株弓形虫，提示细胞培养可作为先天性弓形虫病早期病原诊断的可行性方法。国外学者成功从1例眼弓形虫病患者血液中分离出弓形虫，成功传代1年以上，并进行动物腹腔接种。虽然这两种方法结果可靠，但敏感性低、耗时长、易漏诊和难于实际操作。 　　2 免疫学诊断方法 　　免疫学诊断是弓形虫病调查、诊断的常用方法。检测抗弓形虫抗体或循环抗原的免疫学诊断方法主要有染色试验（DT）、凝集试验（AT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫胶体金技术等。 　　2.1 染色试验（DT） 　　DT曾被视为是弓形虫病特有的血清学检测方法及最有价值的检测手段，具有良好的特异性、敏感性和重复性。但由于在进行检查时必须使用活的、有毒力的速殖子而存在巨大的危险性，限制了其应用。随后在此基础上建立了免疫酶染色试验（IEST），它是以玻片上的甲醛固定的弓形虫虫体作为抗原，与血清样本中抗体反应，加入酶标二抗及底物，以虫体周围出现完整的淡黄色作为阳性标准。该法简单、敏感、特异、快速，可在现场使用。赵恒梅等[2]用该法检测11份阳性兔血清和34份弓形虫病人的血清，阳性率分别为100%和94.1%，与血吸虫病、肺吸虫病、疟疾等均无交叉反应，与间接免疫荧光法（IFAT）无差异。 　　2.2 凝集试验（AT） 　　2.2.1 直接凝集试验（DAT） 此法简便快速，阳性反应出现时间比IHA早。试验以甲醛固定的弓形虫悬液作为抗原与被检血清直接进行反应。在玻片上加不同稀释度的试验血清，混匀，几分钟后在显微镜下观察，如发生凝集，则为阳性反应。 　　2.2.2 间接血细胞凝集试验（IHA） 主要优点是简便、快速、灵敏，已广泛应用于流行病学调查。陈义民等[3]建立了以弓形虫滋养体（速殖子）抗原致敏绵羊红细胞的IHA方法，应用此试剂检测人工感染弓形虫的兔血清，首次检测出抗体的时间为感染后7 d，检出率为100%。在此基础上张德林等[4]又创建了一种以弓形虫代谢分泌抗原致敏羊红细胞的IHA方法，用此方法制备的试剂较前者提前2 d检出血清中的抗体，且在检测结果上两者的符合率100%。 　　除此之外，还有胶乳凝集试验、反向IgM免疫吸附凝集试验、碳粒凝集试验以及在此基础上发展起来的印度墨水免疫反应等检测方法。 　　2.3 间接荧光抗体试验（IFAT） 　　IFAT是以完整死弓形虫为抗原，采用荧光标记的二抗检测特异IgM和IgG。IFAT具有特异、敏感、快速、重复性好等优点。但如有类风湿因子、抗核抗体则存在非特异性染色，可引起假阳性反应，同时判定结果易带主观性。 　　2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA） 　　ELISA是当前诊断弓形虫感染应用最广的技术。间接ELISA法测弓形虫IgM抗体，发现急性病例检出率较高，但类风湿因子阳性者出现假阳性反应。近年来，新发展的双夹心法测IgM，是采用抗IgM抗体包板，样本中的IgG、类风湿因子及抗核抗体等均在第一步