《生物化学》实讲义.docVIP

实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 三、仪器与试剂 1、试剂 1 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 2 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚 3 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。 4 10％NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 1 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。 2 另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH溶液摇匀，然后再加入2滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 3 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 4 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 1 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL 0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min，放置冷却，观察颜色变化。 2 0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴一滴0.1％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。 3 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 3、黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。管 号 1 2 3 4 5 6 材 料 溶液 指甲 头发 0.5%苯酚 0.3%色氨酸 0.3%酪氨酸 （滴） 4 少许 少许 4 4 4 浓硝酸（滴） 2 0 20 4 4 4 酒精灯加热煮沸 现象 逐滴加10%NaOH后现象 蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出（浑浊现象），此现象叫蛋白质的沉淀反应。 （一）蛋白质的盐析作用一、目的意义 了解盐析法及可逆沉淀的原理，学习用盐析法沉淀分离蛋白质。 二、实验原理 盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关：①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。 盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加，实验时要加足够量的盐。 蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。 三、仪器与试剂 1、试剂 ⑴ 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 ⑵ 饱和硫酸铵溶液； ⑶ 10%氢氧化钠溶液； ⑷ 1%硫酸铜溶液。 四、操作方法 1、取蛋白质溶液约2mL于试管中，加入过量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置3分钟则析出沉淀。 （二）重金属盐类沉淀蛋白质 一、目的意义 了解重金属盐类沉淀法的原理，学习用重金属盐类沉淀法沉淀分离蛋白质。 二、实验原理 溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。 重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐（如硫酸铜或醋酸铅）沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解，此时的溶解为生成憎水胶体的缘故。 三、仪器与试剂 1、试剂 ⑴ 蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）； ⑵ 5% CuSO4溶液； ⑶ 3%AgNO