第6章免疫沉淀试验分析.ppt

1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。 技术要点 （二）火箭免疫电泳 第三节 凝胶内免疫沉淀试验 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 原　理 反应介质：凝胶 凝胶的特点： 1、固相的液体 2、多孔的网状结构 3、Ag-Ab复合物网络在凝胶中 原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。 技术要点： 1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散 5.绘制标准曲线 定量试验 一、单向免疫扩散试验 倾注平板　打孔　加样　 放置37℃　24～48h观察沉淀环 一、单向免疫扩散试验 　　 T1为16-24h；T2为24-48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线 　　 t1为16-24h；t2为24-48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线 Mancini曲线 Fahey曲线 待检蛋白质抗原须具备的条件 仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清 已知含量的标准品 待测品含量在1.25?g/ml以上 单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病理血清 一、单向免疫扩散试验 应 用 IgG、IgA、IgM、C3、C4、 转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白 等多种血浆蛋白的检测 技术要点： 1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散 二、双向免疫扩散试验 1.判断抗原或抗体的存在 以及估计相对含量 2.分析抗原或抗体相对分子量 二、双向免疫扩散试验 3.分析抗原的性质 二、双向免疫扩散试验 4.滴定抗体的效价 5.鉴定抗原或抗体纯度 二、双向免疫扩散试验 应 用 1.AFP检测的最早方法 2.血清中含量较高的酶类、细菌病毒感染后血清中产生的抗体的检测 三、免疫电泳技术 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 　　3.增加了分辨率。 　　　 电泳分析 ＋ 沉淀反应 抗原抗体反应 的高度特异性 电泳技术的高 分辨率、快速、 微量 三、免疫电泳技术 电泳（electrophoresis） ：在外加电场的作用下带电颗粒向着其电性相反的电极移动，称为电泳。 电泳迁移率： 定义：同一电场条件下，各种带电粒子在 单位时间内移动的距离。M=cm2/VS 影响泳动的速度的因素: 本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度 溶液pH值 溶液离子强度 电 渗 　 电渗： 电场中液体相对于固体的运动 ①载体的性质 ②缓冲液的离子强度 ③电泳时的电压 电渗方向与样品运动方向一致： 样品迁移率加快 电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退 电泳载体： 琼脂 琼脂糖凝胶 常用浓度：0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性，常温易凝固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。 蛋白质的两性解离性质： --NH2 + H2O　　　　 --NH3+ + OH- --COOH --COO- +H+　　　　　　　 　　 两性离子　　　 pH=pI 电中性，无电泳移动性 pHpI 酸性溶液 带正离子，向阴极泳动　　 　　　　 pHpI 碱性溶液 带负离子，向阳极泳动 原理：双向扩散+电泳 实质上是定向加速度的免疫双扩散技术 比双向扩散试验灵敏度提高8～16倍 （一）对流免疫电泳 通电 － 蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动 抗体球蛋白带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动 ＋ （一）对流免疫电泳 结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。 （一）对流免疫电泳 技术评价： 1.简便、快速,敏感度较双扩提高8-16倍，可测蛋白质浓度达 ug/ml. 2.要求抗原、抗体比例严格 3.不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测 抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。 单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术 （二）火箭免疫电泳 * * * * * * * * * 1 杂交瘤细胞含有