外周血单个核细胞概念.ppt

外周血单个核细胞的分离(peripheral blood mononuclear cell,PBMC) 常用方法 聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation) 分离液的密度是关键：1.077 PBMC包括淋巴细胞和单核细胞 血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液,故位于分层液界面上,这样就可获得PBMC。 步骤 2 – 洗涤PBMC 步骤 3 –台盼蓝染色PBMC 步骤 4 –计数PBMC 1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数 2.计数原则：数上不数下，数左不数右。 3.总数除以4，所得数据×104即为1ml液体中的细胞总数 4.每ml健康成人血可分离出1×106～2×106个单个核细胞 计数PBMC举例 数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，85 总数为： 87+79+91+85=342 一个大方格的平均数为：342/4=85.5 1ml液体中细胞量为：85.5×104 如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的2倍。 * * 步骤 1 - 分离PBMC 采集静脉血约4ml，加入含0.1ml肝素溶液（125-250U/ml）的抗凝管中，混匀 吸取3ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中， 将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入稀释的抗凝血 离心2000rpm×25min 吸取2mlPBS置干净试管中，并与抗凝血混匀 密度梯度离心分离PBMC 用1ml的RPMI-1640或PBS定容细胞，并混匀 将所得PBMC用洗液（RPMI-1640液或PBS）洗涤一次 2000rpm×10min 用毛细吸管仔细吸取第二层的单个核细胞（灰白色层） 用100μl加样器吸取已定容混匀的PBMC100μl与100μl的2%台盼蓝染液混合 用100μl加样器吸取少许加入计数板下，计数 注：该步骤可省略，不染色而直接计数PBMC *