基因工程第三章克隆载体-1剖析.pptVIP

第三章 基因克隆载体Chapter 3 Gene Cloning Vector 计划学时: 4h 第一节 质粒载体 (plasmid vector) 第二节 病毒载体(virus vector) 第三节 染色体定位整合载体(chromosome position fixing vectors) 第四节 酵母人工染色体载体 (YAC vector) 第五节 特殊用途的载体 克隆载体的定义 通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。 载体的特点 有多克隆位点,供外源DNA插入。 多克隆位点(multiple cloning site, polylinker): 具有多个限制酶的识别序列,可供处源DNA片段插入. 携带外源DNA进入受体细胞(receptor cell, host cell)，并能自我复制。 有选择标记基因(marker gene),例如：抗抗生素基因。 载体要安全，对受体安全，不能转入其他生物，尤其人细胞。 第一节 质粒 Plasmid 1.3 质粒的复制 Replication 每次细胞分裂，质粒均可复制传给子代细胞。 一般，细胞中质粒的拷贝数保持稳定。 松驰型质粒：拷贝数多，小质粒。 严紧型质粒：拷贝数少，大质粒。 1.4 质粒的不亲合性 能寓于同一细胞的质粒为亲合性质粒 不能寓于同一细胞的质粒为不亲合性质粒。 1.5 质粒的迁移性 接合质粒：含有 tra基因，可连接宿主细胞和受体细胞，并在两者间转移。 特点: 大，拷贝数少，宿主多，不安全。 非接合质粒：无tra基因， 特点: 小，拷贝多，宿主少，安全，常用载体。 1.6 显性质粒与隐蔽质粒 隐蔽质粒：引入后，受体细胞的遗传特性无变化。 显性质粒：引入后，为受体细胞提供了新的遗传特性。 如：抗抗生素，颜色变化等。 2 质粒载体的构建 2.1 选择合适的出发质粒，并用限制酶切开。 好的质粒应具备： 复制起始位点（Replication Origin，Ori） 标记基因（Marker gene ） 多克隆位点（Multiple cloning site ） 启动子（Promoter ） 终止子（Terminator） 质粒克隆60 3 Ti 质粒载体 Ti 质粒: 农杆菌中可引起寄主产生肿瘤的质粒。 Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 右边界序列更重要。 去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对无明显影响。 （2） Vir区:位于T-DNA上游的一组基因，可引起T-DNA的转移，长度约35kb （3） Con区：含有与农杆菌之间接合转移有关的基因（tra），使Ti质粒在细菌间转移。 （4） Ori区：复制起始区. 3.2 基因转化过程 农杆菌感染后，植物细胞接受刺激释放信号分子，反过来激活农杆菌Ti质粒上的vir基因； 农杆菌粘附到植物细胞壁。 植物激素诱导vir基因表达，其表达产物引起T-DNA脱离质粒 并位移进入植物细胞中,进入植物细胞的T-DNA整合并表达。 3.2、 Ti质粒载体的构建(Construction) 构建Ti质粒克隆载体不是真正用于农杆菌，而是用于植物，农杆菌起介导作用。 二元载体法 利用Vir区和T-DNA区（具T borders）分别构建两个质粒，并转入农杆菌。 Vir区基因群反式作用，将含外源基因的T-DNA转入植物染色体。 * * 1/32 2/32 3/32 4/32 The essential nucleotide sequences of cloning vectors: A replication origin, A drug-resistance gene, Multiple cloning sites. 复制起始位点 抗氨苄青霉素基因 多克隆位点 5/32 1.1 定义 细菌染色体之外的能自主复制的双链环状DNA分子。 Circular, double-stranded DNA (dsDNA) that are separated from the chromosomal DNA in bacteria. 1 质粒的特点 6/32 质粒载体 (Plasmid vector): 以质粒DNA分子为基础构建(construct)而成的克隆载体。 构型: 超螺旋 supercoil Relaxed DNA Supercoil DNA 7/32 1.2 质粒的大小 天然质粒:1kb~100kb 质粒载体较小, 有的只有3kb, 具有作为载体的必须序列即可。 200kb 3kb 8/32 9/32 20