基因工程第一讲——.基本技术剖析.pptVIP

* * 基 因 工 程 原 理 基因操作的基本技术 基因克隆的酶学基础 基因克隆的载体 基因的分离与鉴定 真核基因在E.coli中的表达 植物基因工程 哺乳动物基因工程 第一章 基因操作的基本技术 凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 DNA/细菌转化技术 第一节 凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶电泳 1．琼脂糖的种类： 2．琼脂糖电泳的分离效果： 谱带之间相差十个碱基对以上 （1）常熔点的琼脂糖 （2）低熔点琼脂糖 几十个碱基对到2万个碱基对之间 3. 琼脂糖凝胶电泳的分辨力： 溴化乙锭（EB），用量0.5μg/mL，0.05μg的微量DNA 4. 用途： （1）DNA及RNA分离鉴定、（2）DNA及RNA分子量的测定、 （3）PCR结果的鉴定、 （4）DNA限制酶图谱的制作等。 5．影响DNA琼脂糖电泳迁移率的因素： (1）DNA分子带电多少（2）DNA分子的大小（3）DNA分子形状 6.琼脂糖凝胶中DNA的染色 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 丙烯酰胺（Acr）：CH2=CH－CO－NH2 ,也称为单体 甲叉双丙烯酰胺（Bis ）：（CH=CH-CO－NH）2=CH2，也称为交联剂或双体 1．聚丙烯酰胺凝胶的组成成分： （1）单体浓度有关 （2）交联剂的浓度有关（更主要） （3）单体与双体之间的比例有关 2.聚丙烯酰胺凝胶网孔的大小 3.聚丙烯酰胺凝胶电泳根据电泳方法 4.凝胶电泳的效应： （1）电荷效应、 （2）分子筛效应、 （3）浓缩效应 连续凝胶电泳 不连续凝胶电泳 SDS凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳 基因工程中应用 (1)DNA、RNA可分辨到一个碱基对的差异大小的DNA片段 (2)蛋白质100道尔顿 6.．聚丙烯酰胺凝胶的分辨力 ： 5．聚丙烯酰胺凝胶的分离效果 7．聚丙烯酰胺凝胶电泳的用途 8．聚丙烯酰胺凝胶的染色 （1）DNA及RNA测序 （2）基因表达产物—蛋白质的分离、纯化、分子量的测定 (1)DNA及RNA分离：分辨范围为几个碱基对到1000个碱基对, 最少6bp片段。 （2)蛋白质的分离鉴定：5000—几百万道尔顿 第二节 核酸分子杂交 核酸分子杂交技术的是1968年由Roy Britten 发明的，其原理是：带有互补的特定核苷酸的序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其特定的同源区段特定退火形成双链的结构，如果彼此退火的核酸来源于不同的生物机体，那么如此形成的双链分子就叫杂种核酸分子。核酸的杂交反映出不同生物之间的关系密切与否。 在杂交反应中作为核酸的载体是滤膜，常用的滤膜有硝酸纤维滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤膜（DBM）和二乙胺基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。但常用的是硝酸纤维膜。 一、萨瑟思DNA吸印杂交技术（southern blotting） 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移而结合在适当的滤膜上，然后通过同DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被吸印的DNA片段，这种实验方法叫做DNA吸印杂交技术，由于它是由Southern于1975年首先设计出来的，故叫做萨瑟思DNA吸印杂交技术。 二、诺塞思RNA吸印杂交技术 由于RNA分子不能同硝酸纤维素滤膜结合。所以Southern技术不能直接地应用于RNA的吸印转移。1977年，J.C.Alwine等人发展出了一种新的方法，其基本步骤是将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其它化学修饰的活性滤低上，通过共价交联作用，而使它们永久地结合在一起，这种方法同Southern DNA吸印杂交技术十分类似，所以叫做诺塞思RNA吸印杂交技术（Northern blotting） 1979年 Towbin 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素所标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（western blotting），即免疫印迹。