郭云兰研究生毕论文终版.docVIP

硕 士 学 位 论 文 （2011届） RMP对人肝/肝癌细胞增殖和凋亡的影响 及其机制研究 Effects of RPB5-mediating protein (RMP) on biological property of hepatoma and hepatocyle cells 研究生姓名 郭云兰 指导教师姓名 魏文祥 专业名称 药理学 研究方向 分子肿瘤药理 论文提交日期 2011年4月 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 论文作者签名： 日 期： 学位论文使用授权声明 □ 本学位论文属 　　在 年 月解密后适用本规定。 非涉密论文□ 论文作者签名： 日 期： 导 师 签 名： 日 期： 中文摘要 目的： 本课题主要研究RMP对肝癌细胞增殖和凋亡的影响极其分子机制。体外实验着重研究RMP基因沉默和过表达对肝癌细胞生长增殖能力、迁移能力、粘附能力、细胞周期以及凋亡的影响及其机制。体内则通过裸鼠皮下荷瘤实验，构建裸鼠肝癌移植瘤模型，探讨RMP基因治疗/基因干预对肝癌移植瘤生长作用的机制。 方法： 首先，通过脂质体转染技术将RMP干扰质粒和RMP过表达质粒转染到肝癌/肝细胞中，建立RMP干扰和过表达瞬时表达细胞株，采用RT-PCR方法检测RMP在细胞中的表达水平；MTT法检测不同转染组细胞的生长增殖能力和粘附能力；通过划痕实验检测细胞的迁移能力；PI染色后经流式细胞术检测不同转染组细胞周期的变化；Annexin V-FITC-PI染色后经流式细胞术检测不同转染组细胞凋亡； Western-blot方法检测HL-7702细胞中各转染组细胞凋亡相关基因的表达；我们还通过裸鼠皮下荷瘤实验，建立裸鼠肝癌移植瘤模型，在裸鼠人肝癌细胞SMMC-7721移植瘤的瘤体内注射脂质体-质粒复合物，观察RMP对移植瘤的生长作用的影响；HE染色观察移植瘤细胞形态学变化，免疫组化法检测移植瘤组织中RMP、AFP、Bcl-2、Bax 和P53蛋白的表达。 结果： 体外实验：RMP 干扰质粒和RMP过表达质粒可以在细胞中瞬时表达；RT-PCR结果显示RMP在不同细胞系中均有不同程度的表达，在肿瘤细胞系中的表达水平普遍高于正常细胞系；MTT结果显示RMP可以促进肝癌细胞和正常肝细胞的增值，降低细胞粘附力；划痕实验提示RMP可以促进细胞的的迁移能力；流式细胞术检测细胞周期显示，RMP被干扰后，肝癌细胞出现明显的G2/M期阻滞，而正常肝细胞的周期则没有明显改变；Annexin V-FITC-PI细胞凋亡检测，RMP干扰后，肝癌细胞凋亡率增加，而肝细胞凋率无明显变化。RMP过表达后，肝癌细胞和肝细胞凋亡均有所降低； RMP基因在HL-7702细胞中过表达后，Western-blot方法检测显示促凋亡基因Bax和Caspase3表达下调，凋亡抑制基因Bcl-2表达上调。体内实验：成功构建了裸鼠肝癌细胞SMMC-7721移植瘤模型。RMP干扰组移植瘤生长缓慢，并且HE染色结果显示细胞凋亡增多，免疫组化检测结果提示干扰RMP后，Bax、P53蛋白表达上调，AFP、Bcl-2蛋白的表达下调。 结论： 本实验研究表明RMP在人的不同细胞系中广泛表达，并且在肿瘤细胞系呈现高表达，正常细胞中低表达；干扰RMP基因在体内外均能能有效地抑制肝癌细胞的生长，诱导细胞凋亡，RMP在肝癌的基因治疗/基因干预提方面可能是一个潜在的有价值的作用靶点；在正常肝细胞HL-7702研究中发现，RMP能够促进肝细胞的增殖、增强细胞迁移力和降低细胞粘附力，提示RMP可以使肝细胞恶化甚至有癌变的可能；RMP抑制细胞凋亡的机制可能是通过上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，下调凋亡基因Bax和P53 的表达实现的。 关键词：RMP；肝癌细胞；肝细胞；细胞周期；细胞凋亡 作 者：郭云兰 指导老师：魏文祥  Effects of RPB5-mediating protein (RMP) on cell proliferation of hepatocellular carcinoma cells Abstract Objective: The aim of the test is to investigate the effects of RMP on cell proliferation and apotosis of human hepatocellula